郭振輝, 茆文莉, 陳文雅, 梁嬌, 侯聰艷, 張韌, 何彥麗

廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(廣東廣州 510006)

有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MAP3K3)又稱MEKK3，其編碼的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶3屬于蛋白激酶超家族、MAP3K亞家族，在不同物種間相似性較高。近年來MAP3K3與腫瘤的關(guān)系越來越被人們所關(guān)注，有文獻(xiàn)報(bào)道稱MAP3K3 參與調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，與腫瘤的增殖、分化、細(xì)胞存活和耐藥相關(guān)[1-3]。前期研究中，通過生物信息學(xué)分析及101例肺腺癌臨床樣本的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)MAP3K3表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)[4]，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中MAP3K3基因與肺癌預(yù)后發(fā)展關(guān)系正負(fù)相關(guān)均有報(bào)道，預(yù)后的差異是否僅由于MAP3K3表達(dá)變化所引起尚有爭(zhēng)議。體外實(shí)驗(yàn)可以控制單一因素從而研究基因的功能，為此，我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)上，于2019年6月至2020年12月期間，通過對(duì)人源肺腺癌H1299、A549細(xì)胞株干預(yù)MAP3K3基因表達(dá)，檢測(cè)了其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT表型分子的影響，同時(shí)初步探討了其調(diào)控的下游信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，期待此研究能為開發(fā)肺腺癌靶向治療藥物提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 A549、H1299細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查通過。

1.2 主要試劑 MAP3K3過表達(dá)慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司；shRNA GLPZ MAP3K3 慢病毒包裝顆粒(Lentiviral shRNA Viral Particle Starter Kit, viral particle set)購(gòu)自Thermo Scientific Dharmacon公司； RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào)：8118107)、0.25%Trypsin-EDTA(批號(hào)：1939066)、FBS胎牛血清(批號(hào)：1795588)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Western blot單克隆抗體：鈣黏蛋白E(E-cadherin)、鈣黏蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、MAP3K3、AKT、mTOR、ERK1/2、JNK1/2、CREB及相關(guān)的磷酸化抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；HRP羊抗兔IgG二抗(AS014)購(gòu)自中國(guó)ABclonal公司；BCA法蛋白定量試劑盒(FD2001)和RIPA蛋白裂解液(FD008)購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MAP3K3過表達(dá)及shRNA敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建 在病毒感染前1 d對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，按1、5、10、50、100 MOI梯度加入病毒，感染6 h后去除含病毒培養(yǎng)基，換用含10%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h并觀察熒光，選取熒光強(qiáng)度最大且細(xì)胞存活較多的MOI梯度作為最佳轉(zhuǎn)染濃度；于12孔板中接種每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后換用無血清培養(yǎng)基，加入病毒溶液至最佳濃度，感染6 h后去除含病毒培養(yǎng)基，換用含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h；感染過程定時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，觀察到熒光時(shí)開始用嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，每2 d換液，持續(xù)14 d，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)是否成功，設(shè)置分組為未轉(zhuǎn)染組(Ctrl組)、過表達(dá)MAP3K3轉(zhuǎn)染組(OE組)；在shRNA轉(zhuǎn)染前1 d對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在12孔板中接種每孔3×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后換用無血清培養(yǎng)基，加入配制好的含shRNA轉(zhuǎn)染體系，37℃培養(yǎng)24 h后換用含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h得到MAP3K3基因敲低細(xì)胞株。

1.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 在六孔板中接種每孔1 000個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含10%FBS培養(yǎng)基，每2 d換液，持續(xù)10 d，肉眼觀察見細(xì)胞集落形成后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌后每孔加入1 mL的4%多聚甲醛溶液固定20 min后吸去，加入1%結(jié)晶紫染色20 min后吸去結(jié)晶紫，晾干后拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞集落數(shù)量。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板中接種每孔3×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁且長(zhǎng)滿6孔板時(shí)，用200 μL吸頭劃直線痕，每孔橫豎各劃3條，用PBS輕洗3次去除漂浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野并標(biāo)記，分別在0 h和24 h用顯微鏡拍照記錄。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，用0.25% Trypsin-EDTA消化并收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/mL，將含基質(zhì)膠的transwell小室置于24孔板中，下室加入600 μL含15%FBS培養(yǎng)基，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)24 h；取出transwell小室吸去孔板中的培養(yǎng)基，用棉簽小心擦去上室上部的細(xì)胞，使用PBS輕洗3次，在下室加入600 μL的4%多聚甲醛溶液后將transwell小室放回浸泡固定20 min；吸去4%多聚甲醛溶液后加入1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，置通風(fēng)處晾干；在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照記錄，并使用ImageJ V1.8.0軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EMT與AKT/mTOR信號(hào)通路密切相關(guān)[5]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)，而且能被AKT、ERK激活[6-9]。使用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MAP3K3對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的影響。將經(jīng)過處理的細(xì)胞用胰酶消化并制成細(xì)胞懸液，離心吸去上清液后加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4℃裂解30 min后收集于1.5 mL離心管，4℃ 12 000轉(zhuǎn)離心10 min后取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。每個(gè)泳道上樣20 μg蛋白，10% SDS-PAGE凝膠電泳(120 V，90 min)分離，轉(zhuǎn)印(300 mA，90 min)到 PVDF膜上，5% BSA溶液室溫封閉2 h，分別加入對(duì)應(yīng)第一抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min；HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min；ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集拍照。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建MAP3K3過表達(dá)人肺腺癌細(xì)胞株 使用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)轉(zhuǎn)染MAP3K3基因的人肺腺癌細(xì)胞，結(jié)果見圖1，過表達(dá)MAP3K3基因后，MAP3K3蛋白表達(dá)量顯著上升，說明成功過表達(dá)轉(zhuǎn)染。

圖1 Western blot檢測(cè)過表達(dá)MAP3K3基因結(jié)果

2.2 過表達(dá)MAP3K3對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 使用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)MAP3K3基因后人肺腺癌細(xì)胞的增殖能力變化，見圖2。與Ctrl組相比，過表達(dá)轉(zhuǎn)染MAP3K3基因后，肺腺癌細(xì)胞形成克隆面積顯著增大，細(xì)胞集落數(shù)量顯著增多，表明細(xì)胞增殖活性更強(qiáng)，過表達(dá)MAP3K3基因可促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞的增殖。

圖2 過表達(dá)MAP3K3基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞增殖的影響(1%結(jié)晶紫染色)

2.3 過表達(dá)MAP3K3對(duì)人肺腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ctrl組相比，過表達(dá)MAP3K3基因細(xì)胞的劃痕愈合率顯著上升且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ctrl組相比，過表達(dá)MAP3K3基因后細(xì)胞穿膜數(shù)量增多且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表1～2。

圖3 過表達(dá)MAP3K3基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞遷移及侵襲能力的影響(×100，1%結(jié)晶紫染色)

表1 兩組劃痕愈合面積百分比的比較

表2 兩組侵襲細(xì)胞數(shù)量百分比的比較

2.4 過表達(dá)MAP3K3對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，過表達(dá)MAP3K3基因的A549和H1299細(xì)胞上皮表型標(biāo)志物E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，間質(zhì)表型標(biāo)志物N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)(圖4、表3)，說明過表達(dá)MAP3K3基因能促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞的EMT。

圖4 Western blot檢測(cè)過表達(dá)MAP3K3基因后對(duì)人肺腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白影響

表3 用Ctrl校正的EMT相關(guān)蛋白相對(duì)定量結(jié)果

2.5 過表達(dá)MAP3K3對(duì)多個(gè)信號(hào)通路的影響 過表達(dá)MAP3K3基因后人肺腺癌細(xì)胞的磷酸化AKT和磷酸化mTOR表達(dá)上調(diào)，未磷酸化蛋白表達(dá)無顯著差異。對(duì)ERK(p-ERK)和JNK(p-JNK)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示了與AKT(p-AKT)和mTOR(p-mTOR)相同的變化趨勢(shì)(圖5、表4)。

圖5 Western blot檢測(cè)過表達(dá)MAP3K3基因?qū)ο嚓P(guān)信號(hào)通路蛋白的影響

表4 用Ctrl校正的相關(guān)信號(hào)通路蛋白相對(duì)定量結(jié)果

2.6 過表達(dá)與敲低MAP3K3對(duì)CREB的影響 對(duì)H1299細(xì)胞敲低MAP3K3基因，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3組shRNA中shRNA-1699敲低成功，同時(shí)p-CREB的蛋白水平顯著下調(diào)(圖6-A)；對(duì)H1299細(xì)胞過表達(dá)MAP3K3基因，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p-CREB的蛋白表達(dá)水平上調(diào)(圖6-B)；結(jié)果灰度分析見表5。

注：A:敲低MAP3K3基因；B:過表達(dá)MAP3K3基因

表5 用NTC或Ctrl校正的p-CREB蛋白相對(duì)定量結(jié)果

3 討論

肺腺癌患者約占所有肺癌患者數(shù)量的40%～50%，由于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移形成繼發(fā)性腫瘤，患者病情短時(shí)間內(nèi)惡化，是治療肺腺癌需要面臨的主要問題[10]。EMT是上皮細(xì)胞失去緊密連接，脫離基底膜向流動(dòng)性強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程，與腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此靶向EMT過程是治療腫瘤的一個(gè)重要方法[11]。

MAP3K3作為MAPK家族重要的一個(gè)蛋白激酶，是蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的組成部分，涉及細(xì)胞各種功能，近年來MAP3K3信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系日益受到關(guān)注。MAP3K3處于信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游端，對(duì)許多磷酸化相關(guān)蛋白及其信號(hào)通路具有調(diào)控作用，影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化和存活，其中ERK信號(hào)通路最為典型。MAP3K3可將ERK1/2信號(hào)通路中的MEK磷酸化，磷酸化的MEK將ERK磷酸化而激活其核轉(zhuǎn)錄因子活性[12]。MAP3K3亦可以通過與MEK5結(jié)合形成活化的二聚體激活ERK5，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程[13]。近來文獻(xiàn)報(bào)道MAP3K3與腫瘤藥物耐受、患者預(yù)后間也存有一定關(guān)系，Samanta 等[14]發(fā)現(xiàn)約63%卵巢癌細(xì)胞過表達(dá)MAP3K3，且伴有較高的IκB激酶β(IKKβ激酶)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-kB)活性，采用siRNA使該基因表達(dá)沉默后，可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物(紫杉醇)的敏感度。Hasan等[15]報(bào)道MAP3K3(MEKK3)基因過表達(dá)是食管癌發(fā)生的早期事件，與患者不良預(yù)后有關(guān)。Fan等[3]研究報(bào)道，8%～20%的乳腺癌檢測(cè)有MAP3K3基因擴(kuò)增，將存有MAP3K3基因擴(kuò)增的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-361細(xì)胞株 MAP3K3基因沉默后，可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)TNF和TRAIL因子以及阿霉素、VP-16等化療藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感度, 且可有效抑制乳腺癌細(xì)胞增生和克隆形成。

CREB是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活非常重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在人類的多種腫瘤中過度表達(dá)，如腦膠質(zhì)瘤[16]和非小細(xì)胞肺癌[17]。它可以被許多激酶(包括 AKT和ERK)磷酸化而激活[6-9]，CREB除了可影響癌細(xì)胞的增殖外，還參與調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin[18]的表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)電離輻射可通過激活EGFR-p38/ERK-CREB-1/STAT3-EMT 途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移侵襲[7]。

MAP3K3基因與肺腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不明確，是否參與肺腺癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化亦鮮見報(bào)道。我們通過前期研究發(fā)現(xiàn)臨床肺腺癌組織中MAP3K3表達(dá)水平與間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度相關(guān)，故猜測(cè)可影響機(jī)體免疫功能，而在體外敲除MAP3K3可降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力[4]。本研究使用慢病毒感染人肺腺癌細(xì)胞H1299和A549，在體外構(gòu)建MAP3K3穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及EMT相關(guān)蛋白的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MAP3K3基因可增強(qiáng)人肺腺癌細(xì)胞增殖能力，并促進(jìn)遷移、侵襲及EMT。為進(jìn)一步探明其作用機(jī)制，我們檢測(cè)了過表達(dá)MAP3K3基因的人肺腺癌細(xì)胞中多個(gè)具有功能活性的磷酸化信號(hào)分子：p-AKT、p-mTOR、p-ERK1/2和p-JNK1/2，發(fā)現(xiàn)表達(dá)均有上調(diào)，已有文獻(xiàn)報(bào)道AKT/mTOR[5]、ERK1/2[19]以及JNK[20]信號(hào)通路激活與EMT關(guān)系密切，因此，我們推測(cè)MAP3K3可通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵分子，參與人肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及EMT過程；我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MAP3K3基因的人肺腺癌細(xì)胞中，具有功能活性的p-CREB蛋白表達(dá)水平表達(dá)上調(diào)，而敲低MAP3K3基因使得p-CREB蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，說明MAP3K3基因可能通過調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路分子的磷酸化水平，調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子CREB的磷酸化水平，從而調(diào)節(jié)其功能。

綜上所述，我們推測(cè)MAP3K3通過AKT/mTOR-ERK1/2-JNK/CREB信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，參與肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及EMT過程。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果希望為基于MAP3K3信號(hào)通路開發(fā)新型靶向治療肺腺癌的藥物提供實(shí)驗(yàn)參考。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明沒有利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：何彥麗和張韌設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)研究，茆文莉和郭振輝完成了實(shí)驗(yàn)操作，陳文雅收集并整理了數(shù)據(jù)，梁嬌和侯聰艷作數(shù)據(jù)分析，郭振輝和茆文莉共同完成了論文寫作，所有作者閱讀審核了論文并同意投稿。