劉慧穎，張耀文，蔣丹丹，隋曉璠，孫苓苓（遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧省檢驗檢測認證中心，化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價國家重點實驗室，沈陽 110023）

鹽酸可樂定，化學(xué)名為2-[（2，6-二氯苯基）亞氨基]咪唑烷鹽酸鹽，又名氯壓定，被廣泛用于抗高血壓?，F(xiàn)行質(zhì)量標準《中國藥典》（ChP）2020年版二部中采用TLC法對有關(guān)物質(zhì)進行檢查，但該法操作較煩瑣，靈敏度低，顯色不明顯且維持時間短，無法確切反映該藥的雜質(zhì)情況。因此，為保證本品的安全性，有必要建立靈敏度和準確度更高的有機雜質(zhì)檢測方法。

原料藥的有機雜質(zhì)可能來源于起始原料、副反應(yīng)產(chǎn)物、中間體、降解產(chǎn)物及反應(yīng)中使用的有機試劑等。生產(chǎn)企業(yè)提供的資料顯示，鹽酸可樂定的合成工藝為1-乙?；?2-咪唑啉酮（簡稱雜質(zhì)B）與2，6-二氯苯胺進行縮合反應(yīng)，生成中間體1-乙酰基-2-（2，6-二氯苯胺）-2-（4，5-二氫咪唑）（簡稱雜質(zhì)A），經(jīng)氯化氫乙醇溶液成鹽后，再以醇解反應(yīng)生成鹽酸可樂定。因此，本文以2個起始原料和中間體（結(jié)構(gòu)見圖1）為研究目標，結(jié)合影響因素試驗，探尋鹽酸可樂定的穩(wěn)定性和降解途徑。

圖1 雜質(zhì)A（a）、雜質(zhì)B（b）和2，6-二氯苯胺（c）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of impurity A（a），impurity B（b）and 2，6-dichloroaniline（c）

美國藥典（USP）和英國藥典（BP）均以HPLC法對鹽酸可樂定的有機雜質(zhì)進行檢查。其中，BP對雜質(zhì)A和2，6-二氯苯胺進行了定位，USP則按外標法對雜質(zhì)A和2，6-二氯苯胺進行限度控制。本研究將綜合考察不同條件的色譜行為，優(yōu)化檢測條件，依據(jù)相關(guān)的指導(dǎo)原則建立有機雜質(zhì)的檢測方法，并對兩家生產(chǎn)企業(yè)提供的藥品質(zhì)量進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀配備2489 UV檢測器和2998 PDA檢測器（美國Waters公司），AS10200AD超聲波處理器（Auto Science公司），XP205天平、S400 Seven excellent型pH計（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

鹽酸可樂定對照品（批號：100071-201607，純度：100%，中國食品藥品檢定研究院），雜質(zhì)A對照品（批號：R148AD，純度：99%，USP），雜質(zhì)B對照品（批號：H1929181，純度：98%，Aladdin），2，6-二氯苯胺（批 號：SJGSF-YT，純度：99.9%，TGI），鹽酸可樂定（企業(yè)A，批號：170502、191101；企業(yè)B，批號：20180401、20180402、20191101），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters C8（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.22%辛烷磺酸鈉-甲醇-磷酸（600∶400∶1，用1 mol·L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0），檢測波長：220 nm，流速：1.0 mL·min，進樣量：50 μL。記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、2，6-二氯苯胺和鹽酸可樂定對照品各約18 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙腈1 mL使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成含各對照品均為90 ng·mL的溶液。

2.2.2 靈敏度溶液的制備 精密量取對照品溶液3 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.3 供試品溶液和對照溶液的制備 取本品約18 mg，精密稱定，置200 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取對照品溶液進樣測定，可樂定與雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、2，6-二氯苯胺的分離度均大于1.5；取靈敏度溶液進樣測定，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、2，6-二氯苯胺和可樂定色譜峰的信噪比均大于10，符合要求。

2.4 專屬性試驗和影響因素試驗

取空白溶劑（水）進樣，結(jié)果對已知雜質(zhì)和可樂定的檢出均無影響。

取鹽酸可樂定樣品（企業(yè)A，批號：170502）進行酸、堿、氧化、光照、高溫破壞，配制過程具體如下：

① 酸破壞：稱取樣品約11.5 mg，置25 mL量瓶中，加2 mol·L鹽酸溶液2 mL，放置24 h，加2 mol·L氫氧化鈉溶液2 mL中和，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

② 堿破壞：稱取樣品約11.5 mg，置25 mL量瓶中，加2 mol·L氫氧化鈉溶液2 mL，放置24 h，加2 mol·L鹽酸溶液2 mL中和，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

③ 氧化破壞：稱取樣品約11.5 mg，置25 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 mL，放置24 h，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

④ 高溫破壞：取樣品適量，置120℃加熱4 h，稱取約11.5 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

⑤ 光照破壞：取樣品置日光下照射5 d，稱取約11.5 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

取各破壞溶液10 μL，按擬訂的方法進樣測定，結(jié)果除在氧化條件下有較大降解外，在酸、堿、高溫和光照條件下均較穩(wěn)定。降解產(chǎn)物均能與主峰較好的分離，均無雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2，6-二氯苯胺產(chǎn)生，結(jié)果見圖2。

圖2 影響因素試驗的色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of influencing factors test

2.5 檢出限和定量限

取對照品溶液，用水逐步稀釋，測得鹽酸可樂定的檢測限（以3倍信噪比計）為0.223 ng，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、2，6-二氯苯胺的定量限（以10倍信噪比計）分別為0.185 ng、0.236 ng和0.687 ng。

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取雜質(zhì)A 18.66 mg、雜質(zhì)B 18.15 mg、2，6-二氯苯胺18.33 mg和鹽酸可樂定對照品17.86 mg，分別置100 mL量瓶中，加乙腈1 mL使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密量取1 mL儲備液置100 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。分別精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL置20 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，進樣測定，記錄色譜圖。以絕對進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表1，可樂定和各已知雜質(zhì)在試驗范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 鹽酸可樂定已知雜質(zhì)線性關(guān)系考察(＝5)
Tab 1 Linearity of identified impurities in clonidine hydrochloride(＝5)

化合物 回歸方程 r 線性范圍/ng可樂定 y＝2.911×103x－94.14 1.000 2.23～17.86雜質(zhì)A y＝5.176×103x＋916.9 1.000 2.29～18.29雜質(zhì)B y＝4.654×103x－1.430×1031.000 2.22～17.79 2，6-二氯苯胺y＝3.246×103x－586.3 1.000 2.29～18.33

2.7 準確度和重復(fù)性

取鹽酸可樂定（企業(yè)A，批號：170502）約18.5 mg，精密稱定，置200 mL量瓶中，精密加入“2.6”項下雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2，6-二氯苯胺的儲備液0.1 mL，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。精密量取0.1 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照溶液。同法制備6份，進樣測定，計算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2，6-二氯苯胺的平均回收率分別為96.51%、100.31%和91.29%，重復(fù)性的

RSD

分別為1.5%、1.0%和2.8%，供試品溶液中均未檢出未知雜質(zhì)，表明方法的準確度和重復(fù)性良好。

2.8 中間精密度

按“2.7”項下方法配制供試品溶液和對照溶液，分別由不同分析人員在不同時間于3臺儀器上按“2.1”項下方法測定，結(jié)果雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2，6-二氯苯胺測得量的

RSD

分別為1.4%、2.0%和2.8%，均未檢出未知雜質(zhì)。

2.9 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液，分別于0、5、10、20 h測定，結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定，均未檢出未知雜質(zhì)；雜質(zhì)A、雜質(zhì)B在20 h內(nèi)均較穩(wěn)定（峰面積的

RSD

分別為2.8%和1.8%），但2，6-二氯苯胺隨放置時間延長而減少（峰面積的

RSD

為8.6%），穩(wěn)定性較差。為保證2，6-二氯苯胺定量的準確性，進一步考察了該雜質(zhì)在6 h內(nèi)的峰面積，計算峰面積的

RSD

為2.7%，表明該雜質(zhì)在6 h內(nèi)是穩(wěn)定的，因此，試驗溶液應(yīng)在6 h內(nèi)測定。

2.10 耐用性

取鹽酸可樂定（企業(yè)A，批號：170502），按照擬訂的標準制備供試品溶液、對照溶液和雜質(zhì)對照品溶液，改變流動相pH值（2.8、3.0、3.2）和色譜柱[Waters SunFire C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax Eclipse Plus C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agela Venusil XBP C8（200 mm×4.6 mm，5 μm）]分別進樣測定，結(jié)果各已知雜質(zhì)與可樂定均有較好的分離效果，供試品溶液均未檢出雜質(zhì)。

2.11 測定結(jié)果

對5批鹽酸可樂定樣品的有機雜質(zhì)進樣測定，結(jié)果均未檢出雜質(zhì)，表明兩家企業(yè)對該藥的質(zhì)量控制較好（見圖3）。

圖3 樣品測定代表性色譜圖Fig 3 Representative chromatogram of sample determination

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

選用二極管陣列檢測器，分別對破壞試驗樣品溶液和雜質(zhì)對照品溶液進行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)各已知雜質(zhì)和降解產(chǎn)物在紫外末端均有較大吸收，為了減少流動相中有機溶劑的影響，同時保持與ChP中鹽酸可樂定品種相關(guān)檢測方法的統(tǒng)一，方便日常操作，故選擇在220 nm波長處進行檢測。

3.2 流動相的選擇

本文比較了鹽酸可樂定在ChP（鹽酸可樂定片的含量測定）和USP不同色譜條件下已知雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的檢出情況，因丙基硅基凝膠色譜柱應(yīng)用較少，故未對BP條件進行試驗。結(jié)果：①USP流動相：雜質(zhì)B出峰時間較快（3 min以前）；可樂定出峰時間較快，隨流動相pH值的增大（3.0、6.9、7.6）而略有增加（2.5 min、4.5 min、5.2 min）；降解雜質(zhì)幾乎在主峰前集中出峰，分離度差，不利于定量檢查；雜質(zhì)A的出峰時間受流動相pH值的影響較大，隨pH的增大（3.0、6.9、7.6）而增加（2.8 min、24.6 min、28.5 min）。②ChP流動相：雜質(zhì)B出峰時間在3 min左右，調(diào)整流動相比例為水相-甲醇（60∶40）時，各已知雜質(zhì)和降解產(chǎn)物能完全分離，且不受溶劑干擾，故本文最終采用ChP方法，并對其進行優(yōu)化。

3.3 已知雜質(zhì)的定量方法

結(jié)合各已知雜質(zhì)的線性試驗結(jié)果，計算雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2，6-二氯苯胺相對可樂定的校正因子分別為0.57、0.64和0.90，為保證結(jié)果的準確性，未采用自身對照法定量。耐用性試驗表明，在不同色譜柱上3個雜質(zhì)的相對保留時間略有不同，易造成定位不準。故最終選擇外標法分別對雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和2，6-二氯苯胺定位和定量。

3.4 其他

本文分別考察了混合雜質(zhì)對照品溶液和鹽酸可樂定對照品溶液在C8（Waters C8和Agilent C8）和C18（Agilent Zorbax SB C18和Agilent SBAq）色譜柱上的檢出情況，結(jié)果C8柱有更佳的分離效果和出峰時間。故選擇C8色譜柱進行樣品檢測?；诳蓸范ê透麟s質(zhì)限度的響應(yīng)值，為保證定量的準確性和滿足靈敏度的要求，確定供試品質(zhì)量濃度為90 μg·mL。氧化破壞試驗中，在相對可樂定保留時間約3.5倍時，有降解產(chǎn)物檢出，因此，采集樣品時在此基礎(chǔ)上適當(dāng)延長記錄時間，記錄色譜圖至主峰保留時間的4倍?？疾祀s質(zhì)A在不同溶劑中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，雜質(zhì)A在甲醇-水混合溶劑中不穩(wěn)定，逐漸轉(zhuǎn)化為可樂定，易造成結(jié)果偏低，無法反映原料中該雜質(zhì)的真實量值；雜質(zhì)A在水和乙腈中相對穩(wěn)定，為避免乙腈干擾雜質(zhì)B的檢出，最終選定水作為供試品制備的溶劑。

本文建立的鹽酸可樂定有機雜質(zhì)的測定方法操作簡便，為其質(zhì)量標準的提升提供了參考。