薩出拉，包書茵，那生桑，奧烏力吉*（.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古中蒙醫(yī)藥研究院，呼和浩特 00020；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 00059）

肝纖維化主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細胞外基質(zhì)增生或過度沉積，隨著病情的發(fā)展演變?yōu)楦斡不?，在此進程中及時介入治療、去除刺激因素則可逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，因此通過抗纖維化來阻斷肝硬化。據(jù)文獻報道甘草活性成分能夠有效防治肝纖維化，且國內(nèi)對甘草酸代謝產(chǎn)物的研究成為熱點?？诜什菟岷?，由膽汁排泄進入腸道，一部分被排泄，另一部分甘草酸經(jīng)腸道菌群作用水解為甘草次酸；甘草次酸經(jīng)腸肝循環(huán)再次進入肝臟發(fā)揮藥效。而患者腸道菌群混亂，甘草酸不能被正常水解，從而藥效降低。因此，通過蒙藥炮制甘草，將促進甘草次酸的水解，從而提高藥效，可為研發(fā)有效治療肝纖維化的藥物奠定基礎(chǔ)。

醋浸甘草為豆科植物甘草

Glycyrrhiza uralensis

Fisch.、脹果甘草

Glycyrrhiza inflata

Bat.或光果甘草

Glycyrrhiza glabra

L.的干燥根和根莖的炮制加工品；其具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及保肝作用等生物活性。在老蒙醫(yī)專著《蒙藥醫(yī)語》中記載“甘草主治肝硬化，頗有療效”，經(jīng)了解關(guān)鍵技術(shù)在于獨特的蒙醫(yī)炮制；在《內(nèi)蒙古蒙藥炮制規(guī)范》地方標(biāo)準已起草醋浸甘草質(zhì)量標(biāo)準草案。因本實驗通過四氯化碳（CCl）聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)肝纖維化，初步驗證蒙藥醋浸甘草對肝纖維化改善作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠（220～250 g）（上海斯萊克實驗動物有限公司；動物合格證號：2017000 5049408）。在正常光周期環(huán)境中（晝夜交替12 h），溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%，對大鼠供應(yīng)正常飼料和飲用水，置于籠內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試藥

甘草藥材（共3批次，批號：181113，甘肅岷縣，批號：181210，新疆伊犁，批號：181211，內(nèi)蒙古包頭，均購自亳州康美中藥城），經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院教授渠弼鑒定為豆科科植物甘草（

Glycyrrhiza uralensis

Fisch.）的根，種植品，蒙藥名希和日-額布斯。

CMC-Na、CCl（貨號：30036328、10006464，國藥集團）；橄欖油、白酒、食用醋（超市采購）；高脂飼料（貨號：D12492，華雅思創(chuàng)生物有限公司）；秋水仙堿（貨號：C90102-1g，上海吉至生化科技有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）和Ⅲ型前膠原肽（PⅢP）檢測試劑盒（ELK Biotechnology）；4%多聚甲醛、Masson三色染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）；蘇木精染液、伊紅染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；封閉用羊血清、DAB顯色液（北京中杉金橋）；CYP2E1抗體、NRF2抗體（Affinity）；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、戊巴比妥鈉（國藥集團）；Goat Anti-Rabbit IgG HRP（H＋L）二抗（貨號：111-035-045，Jackson ImmunoResearch）。

1.3 儀器

分析天平（美國OHAUS）；離心機（Eppendorf）；酶標(biāo)儀（Thermo）；石蠟包埋機、冷卻臺（浙江科迪儀器設(shè)備）；石蠟切片機（Thermo scientific）；展片機、烤片機（天津天利航空機電）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；雪花制冰機（雪科）；漩渦混合器（齊林貝爾）；烘箱（上海精宏）。

2 方法

2.1 甘草炮制方法與給藥液的制備

2.1.1 甘草的炮制方法 取甘草藥材，除去雜質(zhì)，水浸泡2 d，切厚片，干燥，食醋浸泡1 d冷透，趁濕加壓蒸煮20 h，干燥；用時碎成粉末；品名為醋浸甘草，在內(nèi)蒙古蒙藥炮制規(guī)范（2020年版）載入。

2.1.2 醋浸甘草（給藥液）制備 取醋浸甘草粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；按照2020年版《中國藥典》甘草項下的方法測定3批醋浸甘草含甘草次酸（CHO）含量為均不少于0.90%。將炮制品粉碎，臨用時用0.5% CMC-Na溶液研磨，制成一定黏度的混懸液，備用（灌胃）。

2.2 大鼠造模、分組及給藥

2.2.1 大鼠肝纖維化造模 隨機將大鼠分為2組，對照組（control）13只，模型組69只。模型組大鼠皮下注射40%～60% CCl橄欖油溶液，0.3 mL/100 g，首劑加倍，每周2次，連續(xù)注射5周，同時給予高脂飼料和10%乙醇，第5周時成功肝纖維化造模。對照組大鼠供應(yīng)正常飼料和飲用水，第2、4、5周的時候，隨機選擇3只大鼠處死，病理染色判斷模型進展。在注射后第5周，眼眶取血，轉(zhuǎn)入無抗凝劑的管子，室溫靜置30 min，然后4℃ 靜置3～4 h，用移液器吸取上層淡黃色血清，轉(zhuǎn)入離心管中，4℃條件下離心（3000 g，15 min），小心取上清液轉(zhuǎn)入新的管子，ELISA檢測ALT、AST、HA、LN和PⅢP。

2.2.2 分組及給藥 隨機將造模成功大鼠分為6組，分別為模型組（model）、陽性組（Col）、醋液組（Vin）、給藥組（低、中、高）。陽性組給予秋水仙堿1.5 mg·kg，皮下注射；醋液組給予醋液2 mL·kg，灌胃給藥；給藥組（低劑量0.8 g·kg、中劑量2.5 g·kg、高劑量5 g·kg）灌胃給藥，持續(xù)4周。

2.3 樣本收集

給藥4周后，大鼠禁食水16 h，先給予大鼠麻醉，腹主動脈取血，轉(zhuǎn)入無抗凝劑的管子，室溫靜置30 min，然后4℃靜置3～4 h。吸取上層淡黃色血清，轉(zhuǎn)入新的離心管中，4℃條件下離心（3000 g，15 min），小心取上清液轉(zhuǎn)入新的管子。取肝臟，用4%多聚甲醛固定保存，觀察肝臟變化。

2.4 肝功能及肝纖維化指標(biāo)測定

血清全自動生化分析儀測定肝功能指標(biāo)ALT、AST、HA、LN和PⅢP水平。

2.5 肝組織病理學(xué)檢測

取各鼠相同部位肝葉，10%甲醛固定進行HE和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度。

2.6 肝組織中CYP2E1和Nrf2的測定

取材，選取待染色切片，烤片，62℃1 h；切片脫蠟，復(fù)水；抗原修復(fù)；封閉內(nèi)源性過氧化物酶；孵育抗體；DAB顯色1 min，自來水終止顯色，鏡檢；蘇木素復(fù)染；脫水，透明；中性樹膠封片；進行200倍視野采集圖片。

2.7 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，作圖軟件為Graphpad prism 5，

P

＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝纖維化造模結(jié)果

給藥前大鼠血清檢測結(jié)果表明，與對照組比較，模型組的大鼠血清ALT、AST、HA、LN和PⅢP均顯著升高（

P

＜0.05）（見圖1）。

圖1 給藥前大鼠血清ELISA檢測結(jié)果Fig 1 ELISA detection in rat serum before the administration

大鼠肝纖維化造模HE染色結(jié)果見圖2，大鼠肝纖維化模型組第2周空泡變性較多（大空泡為主），因脂肪變受壓致使結(jié)構(gòu)變形（大致輪廓可見），大量炎癥細胞浸潤；第4周炎癥細胞浸潤，纖維沉淀清晰可見；第5周結(jié)構(gòu)紊亂，邊界不清晰，肝細胞壞死嚴重，纖維沉淀較多。對照組結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，肝索間隙擴張。

圖2 給藥前大鼠肝纖維化造模后HE染色和Masson染色（×200）Fig 2 HE staining and Masson staining after hepatic fibrosis modeling in rats before the administration（×200）

大鼠肝纖維化造模Masson染色結(jié)果所示，大鼠肝組織模型組第2周中央靜脈和匯管區(qū)有較淡的藍色（纖維化沉淀），大空泡變性為主，較多炎癥細胞浸潤；第4周空泡變性嚴重，有炎癥細胞浸潤，有較多纖維化增生和沉淀，肝細胞壞死較多；第5周肝細胞之間的橋接和肝中央靜脈部分纖維化增生明顯，空泡變小，變多，肝細胞有大量死亡?？瞻讓φ战M無特殊性變化，結(jié)構(gòu)和形態(tài)基本正常，少量肝索間隙增大。

3.2 大鼠肝功能及肝纖維化指標(biāo)的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、HA、LN及PⅢP水平均顯著升高；與模型組比較，陽性組大鼠血清ALT、AST、HA、LN及PⅢP的水平均顯著降低，給藥組SD大鼠血清ALT、AST、HA、LN及PⅢP的水平均顯著降低（見圖3）。

圖3 大鼠肝纖維化肝功能及肝纖維化指標(biāo)影響Fig 3 Effect of hepatic fibrosis on liver function and indexes of hepatic fibrosis in rats

3.3 肝病理組織形態(tài)觀察

HE結(jié)果顯示（見圖4）：對照組肝索間隙增大；模型組有肝細胞增生和纖維化增生，結(jié)構(gòu)紊亂，肝索間隙增大；醋液組和模型組的病理變化相似；陽性組結(jié)構(gòu)基本正常，有少量肝細胞和纖維增生；低、中、高濃度組的樣本結(jié)構(gòu)逐漸好轉(zhuǎn)，膠原纖維增生，隨著濃度的增加，逐漸減少。Masson結(jié)果顯示（見圖5）：對照組門靜脈區(qū)有少量藍色（顯示有少量的纖維存在），模型組匯管區(qū)和中央靜脈有粗大的纖維化著色（藍色），醋液組和模型組幾乎無差別（有較多的藍色存在）；秋水仙堿組肝索間隙增大，結(jié)構(gòu)有點紊亂，有少量纖維存在（藍色區(qū)域）；低、中、高濃度甘草浸液存在一定的量效關(guān)系，隨劑量增大，組織間隙減小，橋接纖維著色變淡、變細。根據(jù)上述說明，醋浸甘草對大鼠纖維化模型具有治療效果。

圖4 大鼠肝纖維化造模后HE染色圖（×200）Fig 4 HE staining after the modeling of hepatic fibrosis in rats（×200）

圖5 大鼠肝纖維化造模后Masson染色圖（×200）Fig 5 Masson staining after the modeling of hepatic fibrosis in rats（×200）

3.4 肝組織CYP2E1和Nrf2水平的影響

如圖6～7所示，模型組大鼠CYP2E1和Nrf2陽性表達明顯為棕色；且位于細胞胞漿中。秋水仙堿組大鼠組織中少見棕色；不同劑量給藥后，肝組織中CYP2E1和Nrf2的表達不同程度地減少。定量分析結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織的CYP2E1和Nrf2水平顯著升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，陽性組大鼠肝組織的CYP2E1和Nrf2水平顯著下降（

P

＜0.05），給藥組大鼠肝組織CYP2E1和Nrf2的水平有所下降（

P

＜0.05）；而醋液組幾乎沒變化。給藥組高劑量效果略等同于陽性組，說明醋浸甘草有明顯改善肝纖維化作用，且呈劑量依賴性。

圖6 大鼠肝纖維化造模后肝組織CYP2E1免疫組化染色圖（×200）Fig 6 Immunohistochemical staining of CYP2E1 in liver tissue of rats with hepatic fibrosis（×200）

圖7 大鼠肝纖維化造模后肝組織Nrf2免疫組化染色圖（×200）Fig 7 Immunohistochemical staining of Nrf2 in liver tissue of rats with hepatic fibrosis（×200）

圖8 大鼠肝纖維化造模后肝組織CYP2E1和Nrf2水平的影響Fig 8 Effect of hepatic CYP2E1 and Nrf2 in rats with hepatic fibrosis

4 討論

蒙醫(yī)藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的重要組成部分，是蒙古族人經(jīng)驗的積累，將有毒、銳性強等藥物，經(jīng)炮制后可降低或消除藥物的毒副作用、改變或緩和藥性，提高藥物療效，蒙藥炮制在保證蒙藥療效、用藥安全等方面發(fā)揮重要作用。《蒙藥醫(yī)語》中記載“甘草具有抗肝硬化作用”，可應(yīng)用蒙醫(yī)炮制方法炮制甘草，從而治療肝纖維化。肝纖維化是臨床多發(fā)的疾病，也是慢性肝病進展為肝硬化的必要環(huán)節(jié)，可常規(guī)中西藥治療肝纖維化臨床效果不顯著，本研究為研發(fā)具有獨特的蒙藥醋浸甘草有效治療肝纖維化的藥物奠定基礎(chǔ)。

甘草是蒙醫(yī)常用的藥材，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、改善胰島素抵抗以及調(diào)節(jié)免疫功能等諸多作用；尤其在國內(nèi)外抗纖維化方面研究的較多；有文獻報道表明，利用多種方法改造或修飾化學(xué)結(jié)構(gòu)獲得甘草次酸及其衍生物，從而提高甘草次酸的生物利用度。也有研究報道，甘草酸由于腸道菌群紊亂不能被正常水解，在臨床上出現(xiàn)假醛固酮增多癥，應(yīng)用被限制。根據(jù)實驗結(jié)果初步推測蒙醫(yī)炮制醋浸甘草可減少假醛固酮增多癥，從而有效改善肝纖維化。本實驗采用化學(xué)毒性的CCl與高脂飲食聯(lián)合誘發(fā)肝纖維化動物模型，此造模方法應(yīng)用廣泛，費用低，操作簡易，造模成功率較高。結(jié)果表明，與對照組相比較，模型組肝功能指標(biāo)（ALT、AST）顯著增加，肝纖維化指標(biāo)（HA、LA、PⅢP）明顯升高；通過觀察HE和Masson染色發(fā)現(xiàn)第5周時模型組大鼠肝細胞壞死嚴重，肝纖維化明顯增生；說明CCl與高脂飲食聯(lián)合成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。與模型組對比，給藥組肝功能和肝纖維化（ALT、AST、HA、LA、PⅢP）等指標(biāo)顯著降低；肝組織細胞色素CYP2E1與轉(zhuǎn)錄因子Nrf2水平顯著降低，說明給藥后大鼠肝纖維化明顯改善；與模型組對比，醋液組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明醋液對肝纖維化無明顯影響。

綜上，本研究蒙藥醋浸甘草飲片與修飾甘草衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)相比操作簡單、費用低，且蒙醫(yī)臨床實踐發(fā)現(xiàn)療效較好，具有鮮明的民族特色。并初步驗證醋浸甘草能有效改善CCl高脂聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化作用，為研發(fā)有效治療肝纖維化的蒙藥醋浸甘草提供理論依據(jù)。