牟建平，滕寶霞*，史中飛，馬尚賢，賀曉文，賴晶，朱玲，肖靜，曾小梅（1.甘肅省藥品檢驗研究院，蘭州 70060；2.國家藥監(jiān)局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，蘭州 70060；.廣河縣人民醫(yī)院，甘肅 臨夏 7100）

黃芪在我國廣泛種植使用，多數(shù)中成藥以黃芪作為君藥?！吨袊幍洹?020年版一部收載黃芪為豆科植物蒙古黃芪

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.var.

mongholicus

（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.的干燥根。黃芪藥材的質(zhì)量不僅與藥材的基因型有關(guān)，還會受到特定生態(tài)環(huán)境的影響，根際微生物群落在植物和土壤之間發(fā)揮著重要作用，良好的根際微生物多樣性能夠維持土壤微生態(tài)的平衡，保證植株正常生長，土壤微生物作為評估土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要指標(biāo)，對植物生長具有重要意義。近年來對藥用植物與根際微生物關(guān)系的研究得到了高度重視，不僅有助于分析并闡明藥用植物與根際有益微生物及有害微生物相互作用的機制等基礎(chǔ)理論，而且也有助于解決藥用植物病害防治、連作障礙等生產(chǎn)實際問題，從而提高藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)。本文基于高通量測序技術(shù)，測定了甘肅6個黃芪產(chǎn)區(qū)的黃芪根際土壤固氮菌多樣性，分析根際土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和組成，為進一步分析根際固氮菌種群結(jié)構(gòu)影響土壤養(yǎng)分釋放和黃芪生長提供資料。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

選擇甘肅省隴西縣、漳縣、靖遠(yuǎn)縣、渭源縣、通渭縣和宕昌縣6個黃芪廣泛的種植區(qū)，均為蒙古黃芪，于黃芪開花生長時期，收集其根際土壤，先挖出根系，抖掉與根系松散結(jié)合的土壤，將與根系結(jié)合的土壤使用無菌刷子刷下來作為根際土壤，裝入無菌封口袋，標(biāo)記，采樣信息見表1。

表1 樣品采集信息
Tab 1 Sample collection information

樣品編號 采集地點 經(jīng)度 緯度 海拔/m LX 隴西縣菜子鎮(zhèn) 104° 28' 14'' 35° 8' 42'' 2153 ZX 漳縣殪虎橋鎮(zhèn) 104° 15' 6'' 34° 47' 42'' 2269 JY 靖遠(yuǎn)縣北灣鎮(zhèn) 104° 38' 42'' 36° 34' 44'' 1373 WY 渭源縣會川鎮(zhèn) 103° 58' 37'' 35° 7' 11'' 2235 TW 通渭縣隴山鎮(zhèn) 105° 40' 68'' 35° 29' 8'' 1986 TC 宕昌縣南陽鎮(zhèn) 104° 20' 21'' 35° 55' 47'' 2318

1.2 DNA抽提和PCR擴增

根 據(jù)E.Z.N.A.soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；固氮菌使用引物：

nifH

F（5'-AAAGGYG GWATCGGYAARTCCACCAC-3'）和

nifH

R（5'-TT GTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3'）進行PCR擴增，擴增程序如下：95℃預(yù)變性3 min，40個循環(huán)（95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s），然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4℃進行保存（PCR儀：ABI GeneAmp 9700型）。PCR反應(yīng)體系為：5×FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs（2.5 mmol·L）2 μL，上下游引物（5 μmol·L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNA聚合酶0.4 μL，模 板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復(fù)。

1.3 IlluminaMiseq測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，USA）進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并 用Quantus Fluorometer（Promega，USA）對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用fastp（https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進行拼接；使用UPARSE軟件（http：//drive5.com/uparse/，version 7.1），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/，version 2.2）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（v138），設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列統(tǒng)計和微生物多樣性分析

通過對樣品高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計，甘肅6個黃芪種植區(qū)樣品（LX、ZX、JY、WY、TW、TC）的

nifH

基因測序分別得到17 047、20 428、15 599、19 898、12 494、15 854條序列；從稀釋曲線（見圖1）可以看出，6個黃芪種植地區(qū)樣品的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序趨于飽和，取樣基本合理，能夠比較真實地反映出這6個地區(qū)土壤樣品中的固氮菌微生物群落，結(jié)合各樣品覆蓋率，覆蓋度均高于99%，測序結(jié)果包含了大多數(shù)固氮菌微生物類群，能夠反應(yīng)固氮菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成。ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表了菌群的豐度和微生物多樣性，從表2可以看出，TC固氮菌的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)最大，說明TC黃芪根際土壤固氮菌群落豐富度和多樣性高于其他樣本。

圖1 固氮菌多樣性指數(shù)稀釋曲線圖Fig 1 Dilution curve of nitrogen-fixing bacterial diversity index

表2 不同黃芪種植地區(qū)土壤固氮菌多樣性指數(shù)分析
Tab 2 Diversity index of soil nitrogen-fixing bacteria in different planting areas

樣品Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)ACE指數(shù)Chao指數(shù) 覆蓋度/%WY 2.5427 0.1302 88.703 87.6 99.98 LX 2.2575 0.1968 84.629 84.1 99.99 TW 2.0419 0.1943 45.034 44.5 99.97 TC 2.7987 0.1919 185.618 185.5 99.96 ZX 2.2908 0.1858 78.606 77.6 99.98 JY 1.8843 0.3355 76.157 74.5 99.95

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

6個甘肅黃芪種植區(qū)域根際土壤中固氮細(xì)菌分屬于2個域、2個界、7個門、12個綱、20個目、28個科、36個屬，共51個種。6個不同地區(qū)根際土壤中固氮菌的分布情況見表3。

表3 不同種植區(qū)土壤根際固氮菌在分類水平上的物種分布Tab 3 Species distribution of rhizosphere nitrogen-fixing bacteria in different planting areas

樣品 域 界 門 綱 目 科 屬 種LX 2 2 6 11 14 16 18 21 ZX 2 2 6 10 14 15 19 23 JY 1 1 5 9 13 15 19 22 WY 1 1 4 7 12 15 21 27 TW 2 2 4 7 10 12 13 16 TC 2 2 7 12 18 24 30 37

甘肅黃芪的6個種植區(qū)其根際土壤固氮菌群落在門類水平上主要類群為變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）。其中變形菌門的相對豐度分別為LX（97.2%）、ZX（86.8%）、JY（98.3%）、WY（74.3%）、TW（98.0%）和TC（91.1%）；藍(lán)藻菌門的相對豐度分別為LX（0.2%）、ZX（12.8%）、JY（0.4%）、WY（25.4%）、TW（1.8%）和TC（2.0%）；6個種植區(qū)的優(yōu)勢菌門均為變形菌門，其中3個地區(qū)ZX、WY和TW的第二優(yōu)勢菌門為藍(lán)藻門，其他3個地區(qū)以未知菌門Unclassified-k-norank-d-Bacteria為第二優(yōu)勢菌門，見圖2。

圖2 門水平的優(yōu)勢固氮菌相對豐度Fig 2 Relative abundance of dominant nitrogen-fixing bacteria at the phylum level

由圖3可知，甘肅黃芪的6個種植區(qū)其根際土壤固氮細(xì)菌群落在綱類水平上主要類群為

α

-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、

γ

-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、Unclassified-p-Proteobacteria和

δ

-變形菌綱（DeltaProteobacteria）等，在6個種植區(qū)中LX、ZX、WY和TW 4個地區(qū)的優(yōu)勢菌綱均為

α

-變形菌綱，相對豐度分別為93.0%、85.4%、71.2%和97.2%；JY的優(yōu)勢菌綱為

γ

-變形菌綱和

α

-變形菌綱，相對豐度為56.6%和31.7%，TC的優(yōu)勢菌綱為未知的Unclassified-p-Proteobacteria和

δ

-變形菌綱（DeltaProteobacteria），相對豐度為44.4%和30.3%。

圖3 綱水平的優(yōu)勢固氮菌相對豐度Fig 3 Relative abundance of dominant nitrogen-fixing bacteria at the class level

由圖4可知，甘肅6個主要的黃芪種植區(qū)黃芪根際土壤固氮細(xì)菌群落在屬水平上包括斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

）、念珠藻屬（

Nostoc

）、地桿菌屬（

Geobacter

）、氮氫單胞菌屬（

Azohydromonas

）、

Unclassified-c-Gammaproteobacteria

、

Unclassified-p-Proteobacteria

、

Unclassified-k-norank-d-Bacteria

、

Unclassified-c-Alphaproteobacteria

、

Unclassified-f-Rhodospirillaceae

、

Unclassified-Opitutaceae

等，相對豐度最高的菌屬為斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

），4個種植區(qū)LX、ZX、WY和TW的占比均在75%以上，JY以未知屬

Unclassified-k-norank-d-Bacteria

為優(yōu)勢菌，TC以未知菌屬

Unclassified-p-proteobacteria

為優(yōu)勢菌。其中，LX的優(yōu)勢菌為斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

，91.1%）、

Unclassified-p-Proteobacteria

屬（3.2%） 和

Unclassified-f-Rhodospirillaceae

屬（2.5%）；ZX的優(yōu)勢菌為斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

，84.1%）和念珠藻屬（

Nostoc

，11.3%）；JY的優(yōu)勢菌為

Unclassified-c-Gammaproteobacteria

（56.4%）、斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

，22.5%）和氮氫單胞菌屬（

Azohydromonas

，8.6%）；WY優(yōu)勢菌為斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

，67.5%）、念珠藻屬（

Nostoc

，23.9%）和

Unclassified-c-Alphapro-teobacteria

屬（3.0%）；TW的優(yōu)勢菌為斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

，94.5%）和

Unclassified-f-Rhodospirillaceae

屬（2.5%）；TC優(yōu)勢菌為

Unclassified-p-proteobacteria

屬（44.4%）、地桿菌屬（

Geobacter

，29.4%）和斯科曼氏球菌屬（

Skermanella

，10.9%）。

圖4 屬水平的優(yōu)勢固氮菌相對豐度Fig 4 Relative abundance of dominant nitrogen-fixing bacteria at the genus level

2.3 固氮菌群落的相關(guān)性分析

根際土壤微生物的OTU韋恩圖，LX、ZX、JY、WY、TW、TC土壤樣本中分別檢測到固氮菌84、77、71、87、43和184個OTU，其中共有的 OTU 為12個，特有的 OTU 依次為23、16、31、23、6和135個，見圖5。

圖5 根際土壤固氮菌OTU venn圖Fig 5 OTU venn diagram of rhizosphere soil nitrogen-fixing bacteria

根際土壤微生物的屬水平韋恩圖，LX、ZX、JY、WY、TW、TC土壤樣本中分別檢測到固氮菌18、19、19、21、13和30個屬，其中共有的屬為8個，TC特有的屬為6個，WY和JY特有的屬各有1個，其余3個地區(qū)為0個，見圖6。

圖6 根際土壤固氮菌屬水平venn圖Fig 6 Genus venn diagram of rhizosphere soil nitrogen-fixing bacteria

2.4 基于種水平的主坐標(biāo)分析

分析6個不同黃芪種植地區(qū)根際土壤微生物群落組成，分別對根際土壤樣品的種水平的固氮菌群落進行主坐標(biāo)分析。不同種植區(qū)分散或聚集的分布情況，結(jié)果見圖7。6個不同黃芪種植區(qū)根際土壤固氮菌主要在PC1（貢獻率為74.55%）上分離，其中JY和TC兩個黃芪種植地區(qū)的固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成與其他4個地區(qū)的差異較大。

圖7 根際土壤中細(xì)菌群落主成分分析圖Fig 7 Principal component analysis of nitrogen-fixing bacterial community in rhizosphere soil

3 討論

豆科作物根際固氮細(xì)菌種類豐富，生物固氮是豆科植物的一個重要特性，通過生物固氮可以利用自然界的氮氣提高中藥材的氮素供應(yīng)需求，從而有效地避免因不合理的人工施肥對黃芪等豆科中藥材質(zhì)量的不利影響。相關(guān)研究表明，固氮菌能夠固氮是因為其體內(nèi)含有一種具有特殊功能的蛋白質(zhì)固氮酶，能夠大量定殖在植物組織內(nèi)部，固定的氮可以直接被植物吸收和利用；固氮菌能夠產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)，如分泌刺激植物生長的激素類物質(zhì)吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等；固氮菌還具有促進植物根際的生理變化和對植物病害的防治作用。

甘肅黃芪的6個主要種植區(qū)的根際土壤固氮細(xì)菌群落在門類水平上主要類群為變形菌門和藍(lán)藻菌門，優(yōu)勢菌群均為變形菌門，變形菌門可以通過同化根系分泌物中的碳水化合物，為自身生長提供碳源，結(jié)果變形菌門相對豐度最高，說明這類固氮細(xì)菌可以利用根系土中的碳源并與黃芪形成一定的共生關(guān)系，促進蒙古黃芪的生長。對6個地區(qū)采集的樣本的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在靖遠(yuǎn)縣和宕昌縣采集的樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)與其他4個地區(qū)的差異較大，靖遠(yuǎn)縣海拔較其他地區(qū)低，而宕昌縣的土壤以暗棕壤、黑鈣土、紅褐土、高山草甸土為主，屬濕涼半干旱和溫寒半濕潤區(qū)，固氮細(xì)菌的群落差異可能與海拔、土壤類型及氣候特點相關(guān)。生物固氮菌的應(yīng)用可以顯著提高豆科類中藥材的質(zhì)量，利用豆類植物與根瘤菌的共生固氮效應(yīng)滿足黃芪對氮素的需求，對提高藥材質(zhì)量以及生態(tài)的發(fā)展可持續(xù)性具有重要意義。

本文初步探討甘肅黃芪種植根際土壤固氮細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為黃芪根際固氮微生物調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分的策略，提升黃芪產(chǎn)量和藥用成分的研究提供基礎(chǔ)。從黃芪的品質(zhì)與固氮菌的互作角度思考，篩選出能夠提高黃芪品質(zhì)的固氮微生物，優(yōu)化黃芪種植生產(chǎn)的管理措施及施肥方式，平衡微生物固氮作用與施肥措施的高效協(xié)同作用，通過改變黃芪根系分泌物的組成，改善黃芪生長土壤的理化性質(zhì)，提高黃芪的產(chǎn)量和品質(zhì)，為黃芪的高效栽培和綠色種植提供一定的基礎(chǔ)，提高黃芪的栽培經(jīng)濟效益。