王容容，柏正平，楊靜，王其美，陳林，盧林竹，蔣益蘭*（.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 40006；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，長沙 400；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 40028）

健脾消癌方是湖南省名中醫(yī)蔣益蘭教授防治大腸癌的經(jīng)驗(yàn)方。全方由人參、白術(shù)、枳實(shí)、蛇舌草、半枝蓮、重樓、甘草等13味藥物組成。方中人參為君，合白術(shù)、茯苓、甘草為四君子湯益氣健脾，以健生化之源，而療諸虛不足，從而達(dá)到扶正固本的目的；黃芪甘溫，益氣補(bǔ)虛健脾為臣；枳實(shí)、郁金行氣除痞，白花蛇舌草、半枝蓮、重樓、藤梨根清熱解毒、消癰散結(jié)，法半夏燥濕化痰，薏苡仁健脾滲濕，以上共用之為佐；甘草調(diào)和諸藥為使。全方藥物配伍精要，攻補(bǔ)兼施，共奏益氣健脾、化瘀解毒之功，順應(yīng)了大腸癌患者“虛、瘀、毒”并存的病機(jī)特點(diǎn)。全方扶正祛邪，標(biāo)本同治，在大腸癌和大腸癌術(shù)后鞏固治療中取得滿意的臨床療效。臨床研究表明，本方能降低大腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，提高生存質(zhì)量，延長生存期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，健脾消癌方能有效延長大腸癌裸鼠生存期，降低裸鼠肝轉(zhuǎn)移率，降低肝組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR-2）蛋白表達(dá)；可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、VEGF等因子影響血管生成；可通過調(diào)控TGF-

β

非Smad信號(hào)通路PTEN-PI3K/AKt信號(hào)通路抑制腫瘤血管形成，從而降低結(jié)腸癌裸鼠模型轉(zhuǎn)移率，提高裸鼠體質(zhì)量，抑制瘤體生長等；并可通過逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生長因子-

β

（TGF-

β

）誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程防治大腸癌轉(zhuǎn)移。中藥復(fù)方由多味藥物配伍而成，其有效成分多，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。對中藥復(fù)方中多成分及其含量進(jìn)行分析鑒定是中藥復(fù)方現(xiàn)代化質(zhì)量控制的重要手段和趨勢。鑒于健脾消癌方防治大腸癌療效確切，有必要對其進(jìn)行全面的質(zhì)量控制研究。本實(shí)驗(yàn)擬對健脾消癌方的指紋圖譜和多組分含量測定進(jìn)行研究，以全面控制該復(fù)方的質(zhì)量，通過建立健脾消癌方的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)一步采用高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜對其主要化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，對其指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析，以期為健脾消癌方制劑的研發(fā)和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1290高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜6530、Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），XPE105型析天平（精度：0.01 mg）、AL204型萬分之一電子天平、XPE105型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），HH電熱恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司），101-2AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），SJIA-10N-50A冷凍干燥機(jī)（寧波雙嘉化器有限公司），KM-500DB型超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）。對照品野黃芩苷（批號(hào)：110842-200403，純度：96.8%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-201720，純度：97.6%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：110920-201606，純度：95.4%）、新橙皮苷（批號(hào)：11857-201703，純度：97.6%）、柚皮苷（批號(hào)：110772-202116，純度：98.5%）、腺苷（批號(hào)：110879-200202，純度：98.9%）（中國食品藥品檢定研究院），蕓香柚皮苷（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)：CHB180917，純度：98.1%），甲醇為色譜純（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?，純水（華潤怡寶飲料有限公司），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

人參（

Panax ginseng

C.A.Meyer），白術(shù)（

Atractylodes Macrocephala

Koidz.），茯 苓[

Poria cocos

（Schw.）Wolf]，甘 草（

Glycyrrhiza uralensis

Fisch），法 半 夏[

Pinellia ternata

（Thunb.）Breit]，黃 芪[

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.]，白花蛇舌草（

Hedyotis diffusa

Willd），半枝蓮（

Scutellaria barbata

D.Don），枳實(shí)（

Citrus aurantium

L.），郁金（

Curcuma.wenyujin

Y.H.Chen et C.Ling），重樓[

Paris polyphylla Smith

var.

chinenisi

（Franch）Hara]，薏苡仁[

Coix lacryma-jobi

L.var.

mayuen

（Roman.）Stapf]，藤梨根（

Actinidia chinensis

Planchon），均由湖南省中醫(yī)藥研究院提供，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科田其學(xué)主任藥師鑒定均符合2020版《中國藥典》要求。制備10批健脾消癌方凍干粉所用的各飲片均源自道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)。

2 方法與結(jié)果

2.1 健脾消癌方凍干粉的制備

稱取人參10 g，白術(shù)10 g，茯苓15 g，甘草6 g，法夏9 g，黃芪15 g，蛇舌草15 g，半枝蓮16 g，枳實(shí)10 g，郁金10 g，重樓10 g，薏苡仁30 g，藤梨根15 g，按10倍生藥量加水，煎煮1 h，保存藥液，藥渣再加入8倍量水，煎煮1 h，合并藥液，濃縮成近2倍水量時(shí)，放置過夜，去沉淀，繼續(xù)濃縮成1.5 g·mL備用。將其置于真空冷凍干燥機(jī)中，經(jīng)預(yù)冷、抽真空、一次升華、凍干72 h，即得健脾消癌方凍干粉。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 精密稱量健脾消癌方凍干粉（樣品S1）0.5 g于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱重，超聲處理30 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 樣品溶液制備 按照“2.1”項(xiàng)下凍干粉制備方法，分別制備人參、白術(shù)、茯苓、甘草、法夏、黃芪、蛇舌草、半枝蓮、枳實(shí)、郁金、重樓、薏苡仁、藤梨根凍干粉。按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別制備對應(yīng)藥材的樣品溶液。

2.2.3 對照品溶液 取蕓香柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、柚皮苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，置于不同量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為1.09、1.02、1.01、1.03、1.02、1.02 mg·L的單一對照品儲(chǔ)備液。

分別精密量取各對照品儲(chǔ)備液適量，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.05 mg·L的混合對照品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Welch UItimate AQC（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇（A）0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～26 min，5%A；26～45 min，5%～30%A；45～63 min，30%～40%A；63～78 min，40%～48%A；78～93 min，48%～70%A；93～108 min，70%～95%A；108～113 min，95%～100%A），進(jìn)樣量5 μL，柱溫30℃，流速1 mL·min，檢測波長254 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 取健脾消癌方凍干粉（樣品S1）供試品溶液，連續(xù)測定6次，以4號(hào)峰（柚皮苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

均≤10.0%，表明儀器精密度良好。2.3.2 重復(fù)性 取健脾消癌方凍干粉（樣品S1）適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測定，以4號(hào)峰（柚皮苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

均≤10.0%，表明該方法重復(fù)性良好。2.3.3 穩(wěn)定性 取健脾消癌方凍干粉（樣品S1）的供試品溶液適量，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣測定，以4號(hào)峰（柚皮苷）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的

RSD

均≤10.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備10批健脾消癌方凍干粉（樣品S1～S10）的供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄各樣品色譜圖，見圖1。

圖1 10批健脾消癌方的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction

2.4.1 參照峰的選定 在10批健脾消癌方凍干粉指紋圖譜中，柚皮苷色譜峰保留時(shí)間適中、峰面積大且穩(wěn)定、分離度好，故選用柚皮苷（峰4）為參照峰。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià)及色譜峰歸屬 將10批健脾消癌方（樣品S1～S10）的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2004版）中，以樣品S1色譜圖為參照圖譜，利用中位數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗寬度0.5 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正并生成對照指紋圖譜（R），計(jì)算相似度。結(jié)果共標(biāo)記了10個(gè)共有峰，10批樣品的HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.981、0.967、0.935、0.976、0.987、0.988、0.988、0.981、0.935、0.987、1.000，表明各批樣品之間差異較小，制備工藝穩(wěn)定，見表1。

表1 10批健脾消癌方特征譜圖相似度
Tab 1 Similarity of characteristic spectrum of 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 對照指紋圖譜S1 1.000 0.945 0.877 0.978 0.964 0.969 0.968 1.000 0.877 0.964 0.981 S2 0.945 1.000 0.880 0.933 0.956 0.961 0.959 0.945 0.880 0.956 0.967 S3 0.877 0.880 1.000 0.884 0.890 0.889 0.887 0.877 1.000 0.890 0.935 S4 0.978 0.933 0.884 1.000 0.956 0.966 0.962 0.978 0.884 0.956 0.976 S5 0.964 0.956 0.890 0.956 1.000 0.987 0.990 0.964 0.890 1.000 0.987 S6 0.969 0.961 0.889 0.966 0.987 1.000 0.997 0.969 0.889 0.987 0.988 S7 0.968 0.959 0.887 0.962 0.990 0.997 1.000 0.968 0.887 0.990 0.988 S8 1.000 0.945 0.877 0.978 0.964 0.969 0.968 1.000 0.877 0.964 0.981 S9 0.877 0.880 1.000 0.884 0.890 0.889 0.887 0.877 1.000 0.890 0.935 S10 0.964 0.956 0.890 0.956 1.000 0.987 0.990 0.964 0.890 1.000 0.987對照指紋圖譜 0.981 0.967 0.935 0.976 0.987 0.988 0.988 0.981 0.935 0.987 1.000

將樣品S10的色譜圖與各樣品色譜圖進(jìn)行比較，確定峰1為白術(shù)、法夏、茯苓、甘草、黃芪、人參、蛇舌草、藤梨根、薏苡仁、重樓共有峰；峰2為半枝蓮、枳實(shí)、蛇舌草共有峰；峰3歸屬于枳實(shí)；峰4歸屬于枳實(shí)；峰5歸屬于半枝蓮；峰6歸屬于枳實(shí)；峰7歸屬于枳實(shí)；峰8歸屬于半枝蓮；峰9為蛇舌草，重樓共有峰；峰10為法半夏，甘草共有峰。根據(jù)對照品信息指認(rèn)了6個(gè)色譜峰，分別為3號(hào)峰（蕓香柚皮苷），4號(hào)峰（柚皮苷），5號(hào)峰（橙皮苷），6號(hào)峰（野黃芩苷），7號(hào)峰（新橙皮苷），10號(hào)峰（甘草酸銨），見圖2～3。

圖2 混合對照品HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance

2.5 健脾消癌方LC-MS分析

液相條件同“2.2.4”項(xiàng)下離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；ESI源溫度325℃；脫溶劑350℃；源電壓4.0 kV；檢測電壓1.0 kV；碰撞電壓130 V；霧化氣（N）流速為8 L·min。通過正負(fù)模式質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)方在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信息響應(yīng)較好，見圖4，根據(jù)其質(zhì)譜信息和裂解規(guī)律，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，共確定34個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表2。

圖4 健脾消癌方總離子流色譜圖Fig 4 Total ion flow chromatogram of Jianpi Xiaoai decoction

表2 健脾消癌方的LC-MS分析結(jié)果
Tab 2 LC-MS of Jianpi Xiaoai decoction

峰號(hào)tR /min 離子模式 實(shí)測m/z 分子式 二級(jí)特征碎片 鑒定結(jié)果 來源1 6.750[M－H]－ 191.0198C6H8O7 111.0103，147.0320 檸檬酸 藤梨根2 7.660[M－H]－ 989.3359C34H18N6O3 179.0584，31.1136，503.1683，665.2233，827.2814未知3 8.267[M－H]－ 243.0622C9H12N2O6 200.0597，152.0383，130.9701，110.0285 尿苷 茯苓/法夏4 11.266[M－H]－ 389.1173C16H22O11 137.0619，209.0489，323.0327 未知5 11.300[M＋HCOO]－ 312.0989C10H13N5O4 266.1040，134.0614，117.0347 腺苷 法夏6 15.478[M－H]－ 282.0918C10H13N5O5150.0447 鳥苷 法夏7 16.961[M－H]－ 344.0516C16H11NO8 150.0465 未知8 31.485[M－H]－ 389.1212C17H18N4O7 101.0280，139.0439，147.0485，165.0620，183.0726，209.0526，227.0637未知10 44.357[M－H]－ 339.0845C13H16N4O5S177.0240 未知11 47.491[M－H]－ 515.1626C22H28O14 161.0278，469.1511 未知12 48.300[M＋HCOO]－ 531.1551C21H10O14 177.0243，485.1472 未知13 55.511[M－H]－ 593.1703C27H30O15 353.0781，473.1229 維采寧-2 半枝蓮14 56.387[M－H]－ 163.0443C9H8O3 119.0532 4-香豆酸 藤梨根15 57.702[M－H]－ 649.2748C38H38N2O8 174.9612，242.9482，347.1954，443.2229，605.2839未知16 59.757[M－H]－ 595.1882C27H32O15 287.0660，151.0087 圣草次苷 枳實(shí)17 59.858[M－H]－ 741.2534C38H38N4O10151.0081，271.0717，339.0842，459.1479，621.1913未知18 61.038[M－H]－ 491.1320C29H20N2O6 268.0485，283.0715 未知19 61.341[M－H]－ 417.1367C21H22O9 255.0747，135.0131，119.0542 甘草苷 法夏/甘草20 62.790[M－H]－ 549.1805C26H30O13 417.1344，255.0745，135.0132 芹糖甘草苷 法夏21 63.295[M－H]－ 463.1236C21H20O12 287.0660，269.0553，243.0729，225.0649，193.0396，181.0185，167.0037，153.0241，139.0077紅花素 7-O-葡糖苷酸 半枝蓮22 64.070[M－H]－ 623.2229C29H36O15 461.1849，179.0396，161.0295 毛蕊花糖苷 半枝蓮23 66.025[M－H]－ 579.1946C27H32O14 271.0719，151.0090 蕓香柚皮苷 枳實(shí)24 68.114[M－H]－ 579.1911C27H32O14 271.0698，151.0078 柚皮苷 枳實(shí)25 69.294[M－H]－ 609.2005C28H34O15 301.0796 橙皮苷 枳實(shí)26 69.664[M－H]－ 623.2199C29H36O15 461，1813，315.1182，251.1182，179.0396，161.0290毛蕊花糖苷異構(gòu)體 半枝蓮27 70.102[M－H]－ 461.0789C21H18O12 285.0414，267.0313，239.0358，175.0239，166.9980，136.9869野黃芩苷 半枝蓮28 71.383[M－H]－ 609.1992C28H34O15 301.0796 新橙皮苷 枳實(shí)29 83.413[M＋HCOO]－ 639.2017C27H30O15 593.2018，473.1536，285.0829 山柰酚-3-O-（6-O-α-L-鼠李糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷蛇舌草30 84.997[M－H]－ 461.0829C21H18O12 285.0463，257.0320，241.0554，213.0591，175.0296，145.0347異黃芩素 7-O-β-D-葡糖苷酸 半枝蓮31 88.266[M－H]－ 1017.4450C41H14N8O25277.1021，607.2902，885.3972 未知32 90.018[M＋HCOO]－ 845.5108C42H72O14 799.5034，637.4463，475.3898，161.0481，119.0373人參皂苷Rg1 人參33 91.939[M－H]－ 1059.4508C44H16N6O27867.3827，927.4046，999.4292 未知34 102.486[M－H]－ 821.4104C42H62O16 351.0593，469.3353，627.3578，645.3691，759.4006甘草酸銨 甘草

2.6 多指標(biāo)成分的含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下各單一對照品儲(chǔ)備液適量，分別稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)儀器信噪比（

S/N

）＝3時(shí)為檢測限，

S/N

＝10時(shí)為定量限。結(jié)果見表3，6種成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表3 健脾消癌方中6種指標(biāo)成分的線性關(guān)系考察
Tab 3 Linearity of 6 components in Jianpi Xiaoai decoction

成分 線性回歸方程 R2 范圍/（mg·mL－1） 檢測限/（μg·mL－1） 定量限/（μg·mL－1）蕓香柚皮苷 y＝2×106x＋1.66×104 0.9999 0.011～4.352 0.78 2.72柚皮苷 y＝2×106x＋3.72×104 0.9995 0.010～5.105 0.73 2.55橙皮苷 y＝1×106x＋1.61×104 0.9999 0.010～4.072 1.02 3.39新橙皮苷 y＝2×106x＋1.26×104 0.9998 0.010～4.120 0.74 2.58野黃芩苷 y＝4×106x－5.33×104 0.9999 0.010～4.024 0.50 1.68甘草酸銨 y＝4×106x＋2.46×104 0.9997 0.020～3.054 0.51 1.71

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨峰面積的

RSD

分別為2.3%、0.67%、6.7%、0.70%、0.19%、4.2%，表明儀器精密度良好。

圖3 健脾消癌方HPLC指紋圖譜色譜圖Fig 3 HPLC fingerprint chromatogram of Jianpi Xiaoai decoction

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一健脾消癌方凍干粉（樣品S1）供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨峰面積的

RSD

分別為2.2%、1.3%、5.6%、0.80%、0.30%、3.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一健脾消癌方凍干粉（樣品S1）的供試品溶液6份，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.59、12.97、2.94、1.33、6.96、0.93 mg·g，

RSD

分別為4.8%、8.9%、5.2%、5.0%、8.6%、3.7%，表明該方法重復(fù)性良好。2.6.5 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知各指標(biāo)成分含量的健脾消癌方凍干粉（樣品S1）約0.125 g，精密稱定，平行6份，分別按照樣品中相對應(yīng)成分含量1∶1加入各對照品溶液。制備供試品溶液后進(jìn)行測定，結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、橙皮苷、野黃芩苷的平均加樣回收率分 別 為101.58%、102.94%、103.48%、100.05%、99.32%、100.08%，

RSD

分別為2.2%、2.2%、3.0%、0.50%、5.3%、4.8%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.6.6 樣品測定 取10批健脾消癌方凍干粉（樣品S1～S10），制備供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算6個(gè)指標(biāo)成分的含量。結(jié)果10批健脾消癌方凍干粉中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為1.80～2.55、12.90～17.86、3.49～5.28、1.26～1.82、6.93～9.47、1.05～1.51 mg·g，見表4。

表4 10批健脾消癌方中6個(gè)指標(biāo)成分的含量(mg·g)
Tab 4 Content of 6 components in 10 batches of Jianpi Xiaoai decoction (mg·g)

序號(hào) 蕓香柚皮苷 柚皮苷 橙皮苷 野黃芩苷新橙皮苷甘草酸銨S1 1.88 15.73 5.03 1.82 8.34 1.05 S2 2.33 17.86 5.28 1.64 9.05 1.43 S3 1.80 12.90 3.49 1.26 6.93 1.13 S4 2.20 16.83 4.61 1.65 9.04 1.51 S5 2.03 14.92 4.14 1.47 8.03 1.28 S6 2.42 17.47 4.85 1.70 9.47 1.46 S7 2.17 16.01 4.53 1.51 8.60 1.22 S8 2.55 16.99 4.79 1.64 9.19 1.28 S9 2.06 14.78 4.14 1.39 7.99 1.15 S10 2.31 16.95 4.60 1.60 9.15 1.29

3 討論

本文首次建立了健脾消癌方中蕓香柚皮苷、野黃芩苷等6種活性成分含量的HPLC-Q-TOFmF法，該方法分離度好、準(zhǔn)確度高，對于控制健脾消癌方配伍前后化學(xué)成分性質(zhì)和含量變化及作用具有重要意義。6種活性成分中，野黃芩苷來源于半枝蓮，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷來源于枳實(shí)，甘草苷來源于甘草/法夏。研究表明，野黃芩苷能夠抑制結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞的體外和體內(nèi)分化，其作用機(jī)制在于下調(diào)hedgehog信號(hào)通路活性；野黃芩苷與順氯氨鉑（DDP）聯(lián)用可提高肺癌A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性，抑制克隆形成，其機(jī)制可能與下調(diào)c-met蛋白表達(dá)有關(guān)；熊果酸能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；

β

-谷甾醇通過與大腸癌中的p53-MDM2相互作用，抑制多藥耐藥，還可以協(xié)同吉西他濱調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和通過抑制Akt/GSK-3

β

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗胰腺癌活性；人參皂苷是人參發(fā)揮抗癌活性的主要成分，如人參皂苷Rh、人參皂苷-Rh-qt、人參皂苷-Rh-qt和人參二醇都具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，抗腫瘤血管生成的作用，并在免疫浸潤、慢性炎癥損傷、腸道菌群、化療耐藥等研究中展示出良好的潛力；異甘草素可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。當(dāng)然，復(fù)方中藥配伍后的化學(xué)成分并不是單味藥物化學(xué)成分的簡單相加，其提取過程中各化學(xué)成分也會(huì)產(chǎn)生變化，這可能是復(fù)方配伍的精髓，也是研究開發(fā)復(fù)方新藥的有效依據(jù)。本課題組后續(xù)將嘗試增加皂苷類、酚酸類及多糖類的指標(biāo)成分，對健脾消癌方的有效成分和作用機(jī)制進(jìn)一步研究，將名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方制備方式、方法標(biāo)準(zhǔn)化。經(jīng)驗(yàn)方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究對中藥復(fù)方制劑的開發(fā)起著關(guān)鍵作用。本研究建立的10批健脾消癌方凍干粉HPLC指紋圖譜相似度高、分離度好，對蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、野黃芩苷、新橙皮苷、甘草酸銨6種指標(biāo)性成分進(jìn)行定性和定量分析，較為全面地反映了該復(fù)方化學(xué)成分信息，可為該復(fù)方藥效活性物質(zhì)作用機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)，為健脾消癌方復(fù)方制劑的研發(fā)提供參考。