黃榮，冷生玲，馮亞嵐，唐麗萍，袁磊，楊健

(1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.綿陽市中心醫(yī)院感染科，四川 綿陽 621000)

寨卡病毒(zika virus，ZIKV)屬黃病毒科黃病毒屬，是單鏈RNA病毒，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(C，prM，E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)[1]。ZIKV主要傳播媒介為伊蚊，性傳播也有報道[2]。成人感染癥狀輕微，但有研究[3-4]顯示，ZIKV感染與新生兒小頭畸形、成人格林巴利綜合征(GBS)存在密切聯(lián)系。ZIKV主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行，2015～2016年巴西寨卡病毒病大暴發(fā)，導(dǎo)致全球約150萬人感染，WHO將ZIKV感染列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[5]。ZIKV對全球已造成較大的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)，尚且無特效藥，接種疫苗成為防控最有效的方式。一些DNA疫苗、滅活病毒疫苗等作為ZIKV疫苗候選株已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[6]。

目前ZIKV的毒力機(jī)制及其介導(dǎo)的免疫效應(yīng)尚不清晰，嵌合減毒活疫苗較DNA疫苗、滅活疫苗來說，免疫原性更強(qiáng)，安全性更高，更適合作為ZIKV疫苗研發(fā)的發(fā)展方向。自90年代來，嵌合疫苗技術(shù)已用于開發(fā)了多種不同血清型的黃病毒疫苗候選株[7-8]，該方法將黃病毒的prM/E序列嵌合已許可上市的其他黃病毒減毒活疫苗的骨架中，均獲得良好的結(jié)果。本課題組在前期以乙腦疫苗株SA14-14-2為骨架嵌合ZIKV的prM/E序列，成功構(gòu)建并拯救乙腦/寨卡嵌合病毒JE/ZIKA，本研究以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探索該嵌合病毒作為疫苗候選株的安全性和有效性，分析JE/ZIKA作為ZIKV嵌合疫苗的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

地鼠腎(BHK21)細(xì)胞為川北醫(yī)學(xué)院病原中心實(shí)驗(yàn)室保存，嵌合病毒JE/ZIKA為本室拯救保存。清潔級昆明鼠，體重10～14 g，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)于川北醫(yī)學(xué)院病原中心BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 病毒的噬斑形態(tài)鑒定 將連續(xù)10倍等比稀釋的嵌合病毒液和乙腦疫苗株SA14-14-2病毒液分別接種于鋪滿BHK21細(xì)胞的6孔板中，0.4 mL/孔，每個梯度設(shè)置復(fù)孔，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，每隔20 min搖晃6孔板1次，使得病毒液與細(xì)胞均勻吸附。吸掉病毒液，將含4%FBS MEM培養(yǎng)基和2%低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混合后加入6孔板中覆蓋細(xì)胞，2 mL/孔，待孔中覆蓋物冷卻后將6孔板放置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，用4%甲醛溶液固定30 min，接著用10 g/L結(jié)晶紫染色10 min，流水沖洗，比較嵌合病毒和SA14-14-2的噬斑大小。

1.2.2 復(fù)制能力檢測 分別以MOI=0.1、0.01、0.001將嵌合病毒接種到鋪滿單層BHK21細(xì)胞的75 cm2的培養(yǎng)瓶中，以MOI=0.01將SA14-14-2同樣接種BHK21細(xì)胞作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h取200 μL上清液于-80 ℃凍存，直到細(xì)胞全部病變死亡。收集1～7 d樣本，用噬斑實(shí)驗(yàn)逐一檢測各個上清樣本中病毒的滴度，以感染時間為橫坐標(biāo)，病毒滴度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.3 神經(jīng)毒力LD50和神經(jīng)侵襲力檢測 用嵌合病毒JE/ZIKA(2.7×106PFU/mL)分別通過皮下和腹腔途徑(輔腦內(nèi)空刺)、腦內(nèi)途徑接種昆明鼠，乙腦疫苗株SA14-14-2做對照，觀察14 d，計(jì)算小鼠死亡率。10倍系列稀釋嵌合病毒至10-7，從10-2稀釋度開始，每個稀釋度腦內(nèi)接種昆明鼠各6只，0.03 mL/只，接種后3 d內(nèi)死亡者不計(jì)，飼養(yǎng)14 d，用Reed-Muench法計(jì)算神經(jīng)毒力LD50。

1.2.4 免疫原性分析 嵌合病毒JE/ZIKA(2.7×106PFU/mL)分別以皮下和腹腔途徑各接種50只成鼠，皮下途徑0.1 mL/只，腹腔途徑0.5 mL/只。于免疫后第1～10周每周采血(每次各采集5只小鼠)，分離血清，測定中和抗體效價(PRNT50)，以 PRNT 50>10為陽轉(zhuǎn)，計(jì)算 GMT。

1.2.5 嵌合病毒JE/ZIKA免疫對自身的免疫保護(hù) 嵌合病毒JE/ZIKA(2.7×106PFU/mL)用不含血清的MEM進(jìn)行10倍系列稀釋至10-5，分別用原倍病毒、10-1、10-3和10-5倍稀釋病毒免疫體重為10～12 g 的昆明鼠共40只，每組各10只，每只皮下注射0.1 mL，免疫14 d后，小鼠腦內(nèi)注射0.03 mL(滴度為100 LD50)嵌合病毒，觀察14 d，計(jì)算5組小鼠的死亡率。

1.2.6 嵌合病毒接種對小鼠乙腦病毒腦炎的交叉保護(hù) 嵌合病毒JE/ZIKA(3.45×106PFU/mL)皮下免疫昆明鼠10只，0.1 mL/只，免疫14 d后，用乙腦野毒株SA14(滴度為100LD50)腹腔攻擊，觀察14 d，記錄小鼠死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 嵌合病毒噬斑鑒定結(jié)果

將嵌合病毒JE/ZIKV和乙腦疫苗株病毒JEV SA14-14-2在BHK21細(xì)胞上噬斑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)嵌合病毒JE/ZIKA噬斑直徑小于JEV SA14-14-2的噬斑直徑。見圖1。

2.2 病毒的增殖曲線

不同MOI收獲的嵌合病毒峰值均可達(dá)到6.5 lg PFU/mL左右，滴度均在接種后第108 h左右達(dá)到高峰，隨后滴度緩慢下降。MOI=0.001接種組病毒滴度上升較慢，但高峰滴度較另外兩組略高。用JE/ZIKA和JEV SA14-14-2分別接種BHK21細(xì)胞(MOI=0.01)，JEV SA14-14-2于接種后60 h內(nèi)病毒增殖較快，在60 h出現(xiàn)復(fù)制高峰后開始緩慢下降，而JE/ZIKA在接種后增殖速度較JEV SA14-14-2快，接種96 h也未達(dá)到高峰滴度。見圖2及圖3。

2.3 神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力檢測結(jié)果

通過皮下及腹腔途徑接種嵌合病毒，各組昆明鼠均未出現(xiàn)發(fā)病或死亡情況，而腦內(nèi)途徑接種組小鼠于14 d全部死亡，SA14-14-2接種組小鼠均健存。分別用10倍梯度系列稀釋JE/ZIKA腦內(nèi)接種昆明鼠，測定JE/ZIKA對3周齡昆明鼠的LD50為2.4 PFU(0.03 mL)，見表1及表2。

表1 嵌合病毒對3周齡小鼠的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力檢測結(jié)果

表2 嵌合病毒對3周齡小鼠的神經(jīng)毒力LD50

2.4 免疫原性分析

對皮下和腹腔接種嵌合病毒小鼠分別每周采血分離血清，皮下途徑免疫的小鼠，中和抗體效價在免疫后第6周達(dá)到高峰，GMT達(dá)到109；腹腔免疫組，在免疫后兩周達(dá)高峰，GMT為107，但以后迅速下降。所有樣本PRNT50≥10，陽轉(zhuǎn)率為100%。見圖4及表3。

表3 嵌合病毒皮下、腹腔免疫后小鼠中和抗體產(chǎn)生情況

2.5 嵌合病毒JE/ZIKA免疫對自身的免疫保護(hù)

稀釋度為10-6和10-5PFU量的嵌合病毒可以對小鼠產(chǎn)生90%的腦內(nèi)攻擊保護(hù)，隨著病毒量的降低，保護(hù)效力也隨之降低，說明病毒顆粒量與小鼠免疫保護(hù)效力的產(chǎn)生存在正相關(guān)關(guān)系。見圖5。

2.6 嵌合病毒接種對小鼠乙腦病毒腦炎的交叉保護(hù)作用

滴度為3.45×106PFU/mL的嵌合病毒JE/ZIKA免疫，可對小鼠受致死量乙腦野毒株SA14的腹腔攻擊產(chǎn)生40%保護(hù)率。見圖6。

3 討論

本課題組前期采用反向遺傳學(xué)技術(shù)用相應(yīng)ZIKV標(biāo)準(zhǔn)株MR766序列替換了乙腦疫苗株SA14-14-2的prM/E序列，構(gòu)建并拯救獲得穩(wěn)定的嵌合病毒JE/ZIKA，進(jìn)行初步毒力檢測發(fā)現(xiàn)該重組嵌合病毒對昆明鼠有較強(qiáng)的腦內(nèi)神經(jīng)毒力[9]，以此為基礎(chǔ)，本研究對嵌合病毒JE/ZIKA的安全性和有效性進(jìn)行了進(jìn)一步評價。在BHK21細(xì)胞中進(jìn)行生物學(xué)特性檢測，發(fā)現(xiàn)相對于骨架乙腦疫苗株SA14-14-2，嵌合病毒JE/ZIKA表現(xiàn)出更小的噬斑，為類似母本株MR766的小噬斑[10]，說明JE/ZIKA可能具有較弱的細(xì)胞浸潤能力，其侵染細(xì)胞后形成的噬斑形態(tài)主要由結(jié)構(gòu)蛋白的特征決定。對比骨架株SA14-14-2，嵌合病毒生長曲線相對更平緩，峰值出現(xiàn)較晚，提示其具有較慢的復(fù)制效率。Yang等[11]研究結(jié)果顯示，嵌合病毒JE/DENV2在細(xì)胞中的復(fù)制效率明顯低于兩種母本株病毒，由于不同黃病毒的蛋白結(jié)構(gòu)及信號序列特點(diǎn)不同，導(dǎo)致黃病毒的種間嵌合可能表現(xiàn)出比母本病毒更低的復(fù)制效率。隨后本研究小組對嵌合病毒的神經(jīng)侵襲力進(jìn)行了評價，發(fā)現(xiàn)JE/ZIKA皮下注射(輔腦內(nèi)空刺)或腹腔途徑接種小鼠均無發(fā)病，說明該嵌合病毒皮下和腹腔神經(jīng)侵襲力弱，猜測可能與其母本病毒MR766神經(jīng)侵襲力較弱有關(guān)[12]。進(jìn)一步對該嵌合病毒進(jìn)行免疫原性評估，發(fā)現(xiàn)在使用JE/ZIKA免疫昆明鼠后第1周，小鼠血清中即檢測出具有保護(hù)效力的中和抗體，抗體在單次免疫7周后保護(hù)效果依然可觀，由于課題組無ZIKV野毒株MR766及ZIKV其它野毒株，該中和抗體效力僅針對嵌合病毒本身，但依然可認(rèn)為JE/ZIKA具有良好的免疫原性。該結(jié)果在昆明鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)，中高濃度的病毒量能夠保護(hù)90%的小鼠免受病毒的致死性攻擊，而隨著免疫原病毒量降低，其對小鼠的保護(hù)效力也隨之下降，說明病毒顆粒量與小鼠抗體產(chǎn)生存在一定范圍內(nèi)的劑量依賴性。

有研究[11,13-14]以SA14-14-2為骨架嵌合DENV不同血清型拯救的嵌合病毒在動物模型中均表現(xiàn)出良好的免疫原性，而且同時具有良好的抗 JEV和抗DENV感染免疫保護(hù)效果。為了檢測嵌合病毒JE/ZIKA是否具有該特性，使用JE/ZIKA免疫小鼠后，用乙腦野毒株SA14進(jìn)行腹腔攻擊，結(jié)果顯示嵌合病毒JE/ZIKA可對SA14產(chǎn)生40%的保護(hù)效力。Li等[15]報道JEV NS1蛋白在抗病毒免疫中有重要作用，因此推測可能是由于JE/ZIKA骨架區(qū)SA14-14-2的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1誘發(fā)了免疫保護(hù)力。ZIKV與JEV同屬黃病毒屬，E蛋白是關(guān)鍵的保護(hù)性抗原[16]，不同黃病毒間E蛋白結(jié)構(gòu)相似，其中ZIKV的結(jié)構(gòu)與DENV存在高度同源性，DENV2序列與ZIKV一致性高達(dá)54%[17]，有學(xué)者[18]報道，ZIKV與其他黃病毒間存在較大的交叉反應(yīng)，因此也不排除交叉反應(yīng)的可能性。

Li等[19]使用ZIKV亞洲分離株FSS13025的prM/E替換SA14-14-2中的相應(yīng)區(qū)域，成功獲得嵌合型chinZIKV，該嵌合病毒與本研究所獲嵌合病毒JE/ZIKV相比較，于埃及伊蚊體內(nèi)未檢測到傳染性，在Balb/c小鼠體內(nèi)神經(jīng)毒力弱，同時免疫原性強(qiáng)，可以產(chǎn)生垂直保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)選用的非洲標(biāo)準(zhǔn)株MR766神經(jīng)毒力強(qiáng)[20]，這可能是導(dǎo)致嵌合病毒JE/ZIKA對小鼠腦內(nèi)毒力強(qiáng)的主要原因之一，但對小鼠基本無神經(jīng)侵襲力，具有良好的免疫原性。此外，ZIKA動物模型及免疫策略的選擇會對嵌合病毒的免疫原性和保護(hù)效力評價產(chǎn)生一定影響。本實(shí)驗(yàn)選用動物為清潔級昆明鼠，是神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的重要造模動物，對神經(jīng)細(xì)胞損傷易感，在腦內(nèi)接種病毒后較Balb/c小鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀明顯且發(fā)病率高，更適合用于ZIKV引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制研究，但昆明鼠并非ZIKV感染的敏感動物模型[21]。

綜上所述，嵌合病毒JE/ZIKA具有良好的免疫原性，可作為潛在的疫苗候選株，但神經(jīng)毒力較強(qiáng)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們還將進(jìn)一步嘗試對該嵌合病毒進(jìn)行位點(diǎn)改造以期降低其神經(jīng)毒力，同時探索JE/ZIKA在ZIKV敏感動物模型中的免疫原性和安全性。