傅麗娟，邢路娟，張萬剛

（南京農業(yè)大學食品科技學院 國家肉品質量安全與工程技術研究中心 南京 210095）

炎癥是一種免疫應激反應，是機體對外界刺激、感染、內源組織損傷等做出的保護性反應，廣泛發(fā)生于機體的細胞、組織和器官等[1]。根據(jù)發(fā)生程度和持續(xù)時間的不同，炎癥可分為急性炎癥和慢性炎癥反應。急性炎癥持續(xù)時間較短，如局部組織損傷導致的發(fā)炎、發(fā)熱、紅腫等。慢性炎癥持續(xù)時間較長，炎癥因子的分泌異常會對組織器官造成長期的影響。當機體發(fā)生炎癥時，具有免疫應答反應的細胞產(chǎn)生異常水平的細胞因子并在組織損傷部位激活和募集，使內皮組織及器官產(chǎn)生炎癥損傷[2]。具有免疫調節(jié)作用的細胞因子包括白細胞介素類（Interleuki，IL）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）及趨化因子等[3]。白細胞介素素類包括促炎因子和抗炎因子，其中促炎因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-12 等，抗炎因子包括IL-4、IL-10 等。由炎癥引發(fā)的組織損傷和免疫功能紊亂與慢性炎癥疾病，如Ⅱ型糖尿病、炎癥性腸病、關節(jié)炎、動脈粥樣硬化和其它心血管疾病等的發(fā)生密切相關[4]。

目前預防和治療炎癥的方法主要是抑制細胞免疫反應，減少促炎細胞因子分泌，干預炎癥信號通路等[5]。臨床上常用的抗炎藥物存在一定的副作用，長期使用可能會導致心血管疾病和消化道出血等[6]。食源性生物活性肽可有效降低炎癥因子分泌，進而起到緩解機體炎癥損傷的作用。例如，大豆酶解得到的三肽VPY 能夠顯著降低結腸腺癌細胞（Colorectal adenocarcinoma cell，Caco-2）和人髓系單核細胞 （Human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1） 中IL-6、IL-17、IL-1β、IFN-γ 促炎性細胞因子的分泌，同時下調由葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate，DSS）誘導的小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ 的基因表達，進而起到緩解結腸組織炎癥的效果[7]。小米醇溶蛋白來源的活性肽IALLIPF 能夠改善結腸炎小鼠的臨床癥狀，降低結腸組織中的髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO） 活性及TNF-α 和IL-6的含量，在結腸炎小鼠模型中表現(xiàn)出較強的抗炎活性[8]。綜上可知，國內外學者開展了諸多關于食源性蛋白質水解物和活性肽抗炎作用的研究，為開發(fā)新型安全抗炎藥物及預防食源性預防炎癥的發(fā)生提供了新的方向。

在炎癥調節(jié)機制方面，Janus 激酶信號轉導轉錄激活因子（Janus kinase signal transduction and transcription activator，JAK-STAT）)、絲裂原活化蛋 白 激 酶 （Mitogen activated protein kinase，MAPK）和核轉錄因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）是細胞內參與炎癥反應的重要信號通路[9-10]。目前，關于抗炎活性肽對細胞炎癥反應的調節(jié)大多與MAPK 和NF-κB 通路相關，如玉米蛋白水解物[5]、酪蛋白水解多肽[11]、乳清蛋白水解物[12]等均可參與NF-κB 信號的調節(jié)。大豆酶解得到的谷?；耐ㄟ^介導鈣離子敏感受體的磷酸化，阻斷NF-κB 和MAPK 通路激活，抑制細胞炎性反應[13]。細胞信號通路介導炎癥反應的發(fā)生及預防是一個復雜的過程，相關調控機制的挖掘和研究將為開發(fā)抗炎活性肽類功能營養(yǎng)分子提供理論保障。結合以上研究背景，本文對抗炎活性肽的來源及其抗炎作用進行綜述，以期為開發(fā)食源性抗炎活性多肽的產(chǎn)品及探明抗炎分子機制提供理論參考。

1 抗炎活性肽的來源

食物中的蛋白質是人體生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)來源，研究發(fā)現(xiàn)食物蛋白經(jīng)消化水解后產(chǎn)生的多肽同樣具有生理調節(jié)活性[14]。食品加工中的發(fā)酵成熟、內源酶降解或外源酶輔助水解及胃腸消化過程均可促進蛋白質降解成為多肽，多肽從源蛋白中釋放進而發(fā)揮特殊的生理調節(jié)活性。眾多的研究證明，從大豆[15]、玉米[16]、雞蛋[17]和魚類[18]等蛋白質中水解得到的生物活性肽均與炎癥反應調節(jié)密切相關。

1.1 動物源抗炎活性肽

動物源抗炎活性肽主要來自乳蛋白、禽蛋白、肉制品中的蛋白質、海洋生物蛋白等。Qian 等[19]采用酶解法制備牡蠣生物活性肽，經(jīng)分離純化得到的TRYP 肽可抑制脂多糖（Lipopolysaceharide，LPS）誘導的小鼠單核巨噬細胞（Mouse leukemia cells of monocyte macrophage，RAW264.7） 中TNF-α、IL-1β、IL-6 和誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達。三文魚副產(chǎn)物來源的三肽PAY 可抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞中NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β 的生成[18]。Ma 等[12]從牛乳清蛋白中酶解得到的多肽組分DQWL 能抑制LPS 誘導的RAW264.7 中IL-1β、環(huán)氧合酶-2 （Cyclooxygenase-2，COX-2）和TNF-α 的表達。

此外，一些食品加工的副產(chǎn)物也是良好的抗炎肽來源，其中畜禽肉制品加工過程中的副產(chǎn)物如畜禽類動物的肌肉、骨、血液、腦、結蹄組織和上皮組織等，可作為一種最廣泛易得的優(yōu)質蛋白質資源。Yang 等[20]從雞軟骨水解物中分離得到組分CCH-I 和CCH-II 可不同程度地降低骨關節(jié)炎大鼠血液中IL-1β、IL-8 和TNF-α 的分泌。

1.2 植物源抗炎活性肽

大豆、小麥、燕麥、玉米、油菜籽等植物蛋白被水解后均可產(chǎn)生抗炎活性多肽。Chen 等[21]從菜豆豆奶中提取的多肽γ-E-S-（Me）C、γ-EL 及LLV可抑制Caco-2 細胞中IL-8、TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎細胞因子的表達。Lunasin 肽是一種從大豆蛋白中經(jīng)水解得到的生物活性肽，在抗炎癥活性調節(jié)方面，Lunasin 可抑制NO 和前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）的產(chǎn)生，降低COX-2 和iNOS 的mRNA 表達，在RAW264.7 細胞中表現(xiàn)出抗炎作用[15]。在玉米來源的生物活性肽研究中，玉米多肽具有清除細胞活性氧自由基的功能，同時還可以顯著降低DSS 所誘導的結腸炎小鼠結腸組織中MPO 的活性及TNF-α 和IL-6 的含量，減輕結腸組織損傷和炎性細胞的浸潤[16]。

2 抗炎活性多肽制備方法

2.1 酶解法

酶解法是制備生物活性肽的常用方法，具有生產(chǎn)條件溫和、成本低、獲得產(chǎn)品安全性高等特點[22]。酶解法制備抗炎活性肽的關鍵是酶的種類和酶解條件。目前，常見的用于制備活性多肽的酶包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等。由于不同酶的酶切位點不同，水解后得到的肽段種類有較大差異，因此選擇合適的酶及控制酶解條件十分關鍵。單一酶水解制備抗炎肽或同一酶水解混合底物時酶解效果會受到限制，不同底物或混合底物需要選擇適當?shù)膹秃厦高M行酶解以獲得目的產(chǎn)物。

于笛等[23]從5 種單一酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶及堿性蛋白酶）中選取3 種水解度較高的蛋白酶進行雙酶分段水解實試驗，比較雙酶組合后的水解效果。結果顯示，胰蛋白酶與堿性蛋白酶分段水解燕麥麩蛋白后其產(chǎn)物水解度最高，對酶解產(chǎn)物進行抗炎活性研究發(fā)現(xiàn)質量濃度在50～200 μg/mL 范圍內，燕麥麩皮肽能顯著下調LPS 誘導的胞外細胞因子分泌水平，且呈現(xiàn)量效關系。袁強等[24]利用堿性蛋白酶及風味蛋白酶組合水解菜籽粕制備菜籽多肽，經(jīng)分離純化得到的TL 肽段能有效抑制LPS 誘導下的RAW264.7 細胞中NO 和PGE2的含量，同時降低細胞iNOS 和COX-2 的表達量。Qian 等[19]采用胃蛋白酶、胰蛋白酶水解制備牡蠣軟組織肽，其中TRYP-2 肽段可選擇性抑制LPS 刺激后RAW264.7促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS 的表達水平。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是運用微生物產(chǎn)生的胞外酶水解蛋白質，具有效率高、成本低、繁殖快、產(chǎn)量高等優(yōu)勢[25]。由于微生物中酶的種類十分豐富，可以滿足多種酶解過程的需要。目前采用的發(fā)酵菌株主要有枯草芽孢桿菌[25]、黑曲霉[26]、米曲霉[27]等。Aguilar-Toalá 等[28]從發(fā)酵牛奶中獲得的生物活性肽具有抗炎、抗溶血、抗氧化、抗突變和抗菌活性，通過對比不同分子質量多肽的活性發(fā)現(xiàn)，分子質量小于3 ku 的多肽在抑制炎癥熱誘導的蛋白變性方面具有更強的活性。陳宇歡[29]從發(fā)酵酸奶模擬胃腸道消化產(chǎn)物中分離的肽組分NBM 和LKBM 能夠降低炎癥狀態(tài)下Caco-2 內促炎癥因子的表達，并提高抗炎癥因子IL-10 的表達。

除了酶解和發(fā)酵法外，酸堿處理、加熱、超聲波等方法也可以用來輔助提取多肽。梁秋芳[16]利用超聲波輔助酶解技術提取玉米中的生物活性肽，發(fā)現(xiàn)超聲波預處理可大幅度改變多肽分子質量分布，其中200～1 000 u 和1 000～3 000 u 分子質量段多肽含量達到63.31%和17.69%，相對于傳統(tǒng)酶解的產(chǎn)率分別增加了11.84%和21.29%。以上方法制備的玉米活性肽可顯著降低TNF-α 誘導的血管內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cell line，EA.hy926） 中黏附因子-1 表達，同時降低結腸炎小鼠結腸組織中的MPO 活性及TNF-α 和IL-6 的分泌。在病理學觀察中，玉米活性肽可顯著改善結腸炎小鼠結腸組織的形態(tài)學特征，減輕結腸組織損傷及炎性細胞的浸潤，對腸道健康起到潛在的保護作用。Iskandar 等[30]發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓處理后，乳清蛋白的消化率和多肽的釋放量均得到顯著提升；在抗炎活性方面，乳清蛋白生物活性肽可顯著降低上皮細胞IL-8 的分泌并提升細胞總活力。

3 抗炎活性肽研究方法

3.1 食品源性抗炎活性肽的體外研究

細胞培養(yǎng)技術為研究食源性多肽的功能性提供了經(jīng)濟、快速和可重復的方法。常用于體外抗炎活性研究的細胞類型有：RAW264.7、Caco-2、EA.hy926、血管內皮細胞（Endothelial cells，ECs）、小鼠胰島β 細胞 （Mouse insulinoma beta cell，MIN-6）、小鼠脂肪前體細胞 （3T3 F442A Adipocytes，3T3-F442A）、THP-1、小鼠脂肪細胞（3T3-L1 preadipocyte，3T3-L1）、結腸癌細胞（Human colon cancer cells，HT-29）等。生物活性肽在細胞中的抗炎研究詳見表1。

表1 生物活性肽在細胞中的抗炎活性研究Table 1 Anti-inflammatory activity of bioactive peptides in cells models

Suttisuwan 等[38]從鏈球菌中分離、純化和鑒定了分子質量小于3 ku 的多肽，其顯著降低LPS 誘導的RAW264.7 中iNOS、IL-6、TNF-α 和COX-2的表達。Majumder 等[39]發(fā)現(xiàn)來自卵鐵蛋白的生物活性肽IRW 和IQW 在ECs 中表現(xiàn)出抗炎作用，其中IRW 孵育可顯著抑制LPS 誘導ECs 中IL-8的分泌以及ICAM-1 和VCAM-1 的表達。Sun 等[40]研究發(fā)現(xiàn)玉米來源的多肽可緩解LPS 刺激MIN-6后釋放的IL-6 水平。此外，大豆來源的三肽VPY[7]和PLV[36]均表現(xiàn)出良好的抗炎活性。VPY 可抑制LPS 誘導的THP-1 細胞中TNF-α 的分 泌。在RAW264.7 和3T3-L1 細胞共培養(yǎng)體系中，PLV 可抑制體系中TNF-α、IL-6 和MCP-1 的釋放。

3.2 食源性抗炎活性肽的動物體內研究

生物活性肽的體內試驗主要采用化學物質誘導的炎癥性動物疾病模型，使用的化學誘導劑包括：DSS、2，4，6-三硝基苯磺酸、噁唑酮、乙酸、碘乙酰胺等[41]；此外，細菌誘導或基因工程等方式也可以用于建立動物疾病模型。目前，常用的模型動物包括：巴比西小鼠（Bagg's albino，BALB/c）、免疫缺陷型小鼠 （Non-obese diabetes-scid，NODSCID）、雄性SD 大鼠（Sprague dawley，SD）、自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneous hypertension rat，SHR）、基因缺陷小鼠（Apolipoprotein e-deficient mice，ApoE）等。生物活性肽的體內研究詳見表2。

表2 生物活性肽在動物模型中的抗炎活性研究Table 2 Anti-inflammatory activity of bioactive peptides in animal models

Zhang 等[33]在DSS 誘導的雌性BALB/c 小鼠結腸炎模型中發(fā)現(xiàn)，γ-EV 和γ-EC 的飲食干預可降低結腸組織中IL-6、TNF-α、IL-1β、INF-γ、IL-17 的表達，同時增加了抗炎因子IL-10 的表達。源自牡蠣的肽QCQCAVDGGL 可通過增加脾臟T 淋巴細胞活性抑制CD4+/CD8+的分泌，降低血清免疫

球蛋白E（IgE）的濃度，對小鼠結腸炎具有緩解效果[19]。在小鼠結腸炎淋巴細胞的研究中，源自酪蛋白的糖巨肽（Glycomacropeptide，GMP）具有促進抗炎細胞因子如IL-4 和IL-10 分泌的效果，同時GMP 可下調由T 細胞轉移而引起的IFN-γ 的分泌[42]。從大豆中水解得到的活性多肽VPY 可降低小鼠結腸炎癥水平，其中TNF-α、IFN-γ 和IL-1β的分泌均得到有效緩解[7]。大豆源Lunasin 可抑制由氣道炎癥誘導的雌性BALB/c 小鼠的炎癥浸潤、Th2 細胞因子的表達和杯狀細胞的發(fā)生[13]。此外，Lunasin 還可降低Wistar 雄性大鼠T 淋巴細胞活化標志物CD69+和CD25+的表達，減少膜液中IL-12、TNF-β 的分泌，增加IL-4、IL-10 的分泌，具有調節(jié)細胞免疫微環(huán)境的功能[44]。

4 食源性抗炎活性肽的氨基酸組成

氨基酸組成、疏水性、C 末端和N 末端的殘基類型等都會影響肽的生物活性[45]。通過分析抗炎活性肽序列發(fā)現(xiàn)，在肽鏈N 端和C 端帶正電荷和疏水性氨基酸對其抗炎活性具有促進作用[46]。目前發(fā)現(xiàn)的許多抗炎活性肽都含有帶正電荷的氨基酸，如精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）。在金槍魚汁液[47]和莧菜蛋白[48]中鑒定出了PRRTRMMNGGR、GPR，其C 末端均含有Arg，并且在LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎活性。在大豆蛋白生物活性肽的研究中，5～10 ku 的活性組分可有效抑制RAW264.7 中前列腺素D2和NO的產(chǎn)生，從中分離出的5 個肽段（QQQQQGGSQSQ、QEPQESQQ、QQQQQG、GSQSQSQKG、PETMQQQQQQ）中都富含谷氨酰胺（Gln）[49]。此外，IQW 和QEPVL 肽段中包含至少一個Gln 殘基[11，35]，因此推測Gln 可能對其抗炎活性具有重要作用。疏水性氨基酸有助于抗炎活性的發(fā)揮，如IPP、VPP[34]、IRW、IQW[35]和PLV[36]，其N 端氨基酸均具有較高的疏水性。除IPP 和VPP 外，其它抗炎活性肽中的脯氨酸（Pro）存在比例較高，如VPY[7]、PAY[18]和PLV[36]。疏水性氨基酸的存在可增強肽與細胞膜之間的相互作用，有助于生物活性肽參與細胞內信號通路的調節(jié)，從而發(fā)揮抗炎功能[50]。

5 食源性抗炎活性肽參與的信號調節(jié)通路

炎癥相關的調節(jié)通路主要包括NF-κB、MAPK 等分子途徑[51]。NF-κB 蛋白家族可調控炎癥、氧化應激、免疫反應等細胞代謝過程。NF-κB的過度激活會引發(fā)機體自身的免疫反應、慢性炎癥以及惡性腫瘤等風險。炎癥反應初期細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX-2）的表達均都受NF-κB 的調控[3]。NF-κB 一般以二聚體方式在胞漿內存在，其中p50/p65 是NF-κB 的主要存在形式。p50 和p65 可自由地遷移到細胞核中并激活與炎癥、生長控制、細胞黏附和凋亡有關的基因[52]。p50 的同二聚體是轉錄抑制因子，而p65/p50 的異二聚體是轉錄激活因子。核因子抑制蛋白（Inhibitor of NF-κB，IκB）可通過結合p65 來抑制NF-κB。此外，NF-κB 通路可通過IκB 絲氨酸磷酸化、IκB 酪氨酸磷酸化方式被激活[53]。MAPK 是生物體內重要的信號轉導途徑，廣泛參與機體生長、分裂、分化、凋亡等生理過程。生長因子、細胞因子、外界刺激等因素均可激活MAPK 信號轉導通路進而調節(jié)細胞內代謝途徑。MAPK 通路的基本組成是三級激酶模式，包括MAPK 激酶激酶、MAPK 激酶和MAPK，這3 種激酶能依次激活和逐級磷酸化，共同調節(jié)細胞的生長、分化、應激、炎癥反應等多種重要的細胞生理、病理過程[54]。MAPK 家族成員包括c-Jun 氨基末端激酶 （c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 及細胞外調節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK），其中ERK 激酶能誘導NF-κB 活化。另外，與炎癥相關的調節(jié)通路如干擾素基因刺激因子 （Stimulator of interferon genes，STING），在外源病原菌入侵后可發(fā)揮炎癥調節(jié)功能，其表達的上調或過度活化與免疫性疾病密切相關[55]。

Liang 等[5]從玉米蛋白水解物中提取的生物活性肽能有效抑制EA.hy926 中ROS 的產(chǎn)生，阻止NF-κB 信號通路激活并抑制TNF-γ 的下調和p65 磷酸化過程。Chakrabarti 等[34]發(fā)現(xiàn)酪蛋白來源IPP 或VPP 可提升細胞內脂質積聚，促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ 和脂聯(lián)素的上調。同時IPP 和VPP 可通過抑制IκB 磷酸化來抑制NF-κB通路激活，發(fā)揮有效的抗炎作用。γ-EC 和γ-EV可通過變構激活鈣敏感受體觸發(fā)細胞JNK 和Iκ-Bα 信號轉導途徑，進而調節(jié)NF-κB 和MAPK 信號通路級聯(lián)反應，對腸道細胞的炎癥發(fā)揮調節(jié)作用[43]。在分化成熟的脂肪細胞中，γ-EV 同樣介導鈣敏感蛋白的激活，抑制由TNF-α 引發(fā)的脂肪細胞炎癥MCP-1 和IL-8 細胞因子的分泌，同時提升脂聯(lián)素水平，對脂肪細胞炎癥發(fā)揮調節(jié)作用[56]。炎癥刺激因子LPS 是細胞膜受體CD14 和TLR-4激活劑，具有活化NF-κB 誘導炎癥的作用。乳清蛋白生物活性肽能夠抑制LPS 引起的細胞中TNF-α、IL-8 分泌，然而對TNF-α 和IL-1β 誘導的IL-8 分泌無顯著影響。在調控通路方面，乳清蛋白生物活性肽雖不能下調TLR4 受體的表達，但可能通過抑制LPS 與TLR4 受體的結合進而阻斷NF-κB 通路，發(fā)揮緩解炎癥的作用[30]。此外，從小麥麩質水解物中分離出的pEL 參與了IκBα 降解和MAPK 磷酸化過程，進而緩解由LPS 刺激引起的RAW264.7 中NO、TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生[32]。綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，食源性抗炎活性肽主要通過參與NF-κB 和MAPK 途徑介導細胞炎癥過程，其主要的抗炎過程可見圖1。

6 結語

隨著對生物活性肽研究的不斷深入，抗炎生物活性肽也越來越得到關注?？寡谆钚噪目赏ㄟ^介導炎癥通路受體蛋白參與細胞因子的分泌及炎癥介質的合成，進而發(fā)揮重要的生理調節(jié)功能。在細胞模型中，抗炎肽可緩解由外源刺激引起的免疫細胞、上皮細胞促炎因子的釋放，提升細胞活力。在動物模型中，抗炎肽具有緩解結腸炎、免疫系統(tǒng)功能等作用。作為潛在的抗炎活性物質，目前對生物活性肽的炎癥機制研究主要集中于NF-κB和MAPK 等信號通路的調節(jié)，深入挖掘抗炎肽的結構與抗炎通路蛋白的相互作用，可為炎癥預防提供新的思路。在慢性疾病的預防方面，抗炎活性肽的動物模型與人體內的生理調節(jié)功能還有較大的差距，進一步展開生物活性肽的體內代謝及疾病模型研究，是抗炎活性肽開發(fā)的重要方向。