龔意輝，周桂花，彭淑君，吳志蒙，劉 潔，黃 華，陳致印*

（1 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 湖南婁底 417000 2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室 廣州 510640）

柑橘是我國南方重要的特色水果，也是世界上栽培面積最廣的水果之一。柑橘因色澤鮮艷、果汁豐富、營養(yǎng)價值、保健及藥用價值高等特點而受到廣大消費者的青睞。我國是柑橘的原產(chǎn)地之一，栽培歷史悠久，且品種資源豐富。目前柑橘產(chǎn)業(yè)是我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。

柑橘果實褐斑?。˙rownspot）又稱干疤病，是柑橘果實低溫貯藏中普遍發(fā)生的一種生理失調(diào)病害，尤其是甜橙類果實褐斑病發(fā)病率高達20%～50%，嚴重時高達90%[1-2]。褐斑病的發(fā)生嚴重降低了柑橘果實的外觀品質(zhì)，其病斑部位更容易受到炭疽病、青霉病和綠霉病等病原菌的入侵而導(dǎo)致果肉變質(zhì)和果實腐爛。果皮褐斑病不僅嚴重影響果實外觀光潔度和果實的風(fēng)味，而且降低了鮮銷果實的出口價格和國際市場競爭力，嚴重制約了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前柑橘褐斑病的形成機制仍存爭議，影響了采后貯藏保鮮過程中褐斑病控制方法的研發(fā)。

在代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，主要采用靶向（Targeted metabolomics） 或非靶向（Untargeted metabolomics）的代謝組學(xué)技術(shù)來研究生物樣品中的代謝物，在水果品質(zhì)和可靠性評估等多個研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用[3-4]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、核磁共振技術(shù)（NMR）等技術(shù)的發(fā)展推動了代謝組學(xué)的快速發(fā)展。這些技術(shù)有助于分析生物樣本的各種各樣的代謝物[5]。非靶向的代謝組學(xué)技術(shù)具有快速、簡單、節(jié)省時間和成本，適合大樣本分析的特點[6]。目前，利用代謝組學(xué)技術(shù)研究采后果實生理病害發(fā)生過程中代謝物差異已有較多的報道。Busatto 等[7]利用靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究蘋果虎皮病發(fā)生過程中相關(guān)代謝化合物，發(fā)現(xiàn)蘋果酚類物質(zhì)主要為綠原酸、根皮苷、兒茶素、表兒茶素、黃酮醇化合物，其中總酚在虎皮病較嚴重的果皮中的含量明顯高于果肉。Farneti 等[8]利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性化合物6-甲基-5-庚烯-2-酮（6-Methyl-5-hepten-2-one，MHO）與蘋果虎皮病的發(fā)生有密切的關(guān)系。目前，國內(nèi)外主要從酶促褐變、冷害、膜脂過氧化、氣體傷害、乙烯等因素研究柑橘褐斑病的形成機制，而采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對采后柑橘果皮褐斑病形成過程中差異代謝物的變化規(guī)律及代謝途徑等的研究鮮見報道。本研究以甜橙果實為研究材料，結(jié)合聚乙烯（Polyethylene，PE）包裝處理，利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究采后柑橘褐斑病發(fā)病過程中的代謝物，以探明相關(guān)代謝化合物與褐斑病的相關(guān)性，為控制褐斑病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以甜橙果實為試驗材料，在漣源曲溪柑橘基地采摘果實，挑選果實大小一致、色澤均勻、無病蟲害、無機械損失的優(yōu)質(zhì)果實。采摘完后立即運到實驗室進行試驗處理。將挑選好的甜橙果實按12個一組裝入聚乙烯（PE）保鮮袋中，用橡皮筋綁緊封口后放置于溫度為（15±1）℃、相對濕度85%的恒溫箱中貯藏42 d。同時，以不做任何處理的甜橙果實放置于相同貯藏條件下作為對照組，每個處理均做3 次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)3 個果實。分別在貯藏0，14，28，42 d 進行果皮取樣，將果皮迅速用液氮充分浸泡，徹底凍結(jié)后立即用錫箔紙包裝，放入自封袋置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。

1.2 儀器與試劑

Q ExactiveTMHF-X 質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC 色譜儀，德國Thermo Fisher 公司；色譜柱Hypesil Gold column （100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、甲醇、醋酸銨、甲酸等質(zhì)譜試劑，美國Thermo Fisher 公司；D3024R 低溫離心機，美國Scilogex 公司；聚乙烯（PE）保鮮袋（規(guī)格為400 mm×400 mm，雙層膜厚度均為0.05 mm），廣州成碩化玻有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 褐斑指數(shù)的測定 參照高雪等[9]和Knight等[10]的方法略作修改。褐斑分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0 級：果皮完全無褐斑；1 級：0～1/4 面積果皮出現(xiàn)輕微褐斑；2 級：1/4～2/4 面積果皮出現(xiàn)褐斑；3 級：2/4～3/4面積果皮出現(xiàn)褐斑；4 級：3/4～4/4 面積果皮出現(xiàn)嚴重褐斑。

褐斑指數(shù)=Σ （褐斑級別×該級別果實占總果實的百分比）。

1.3.2 代謝物的提取 參照Want 等[11]的方法并稍作修改。稱取100 mg 經(jīng)液氮研磨至粉末的甜橙果皮樣品，加500 μL 80%甲醇充分振蕩混勻，將各樣品在冰浴中放置5 min，在4 ℃、15 000×g 條件下離心20 min，取上清液加入質(zhì)譜級H2O 稀釋至甲醇體積分數(shù)為53%；在相同條件下再離心20 min，然后從每個樣品中取550 μL 放入新的樣品管中，并記錄好樣品名稱和順序，最后從每個試驗樣本中取30 μL 混勻作為QC 樣本；以53%甲醇作為空白樣本，前處理過程與試驗樣本相同。將以上各樣品保存至樣品瓶中，用于后續(xù)LC-MS 分析。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；正模式：流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸，流動相B：甲醇；負模式：流動相A：5 mmol/L 醋酸銨、pH 9.0，流動相B：甲醇；進樣量100 μL；色譜梯度洗脫程序如表1所示：

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of chromatographic

1.3.4 代謝物檢測 采用高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀對質(zhì)譜柱洗脫下來的所有代謝物分別進行正、負離子模式檢測，其中正離子模式檢測范圍選擇m/z 100～1 500；ESI 源的設(shè)置如下：毛細管電壓3.2 kV，氣體Ⅰ（GSⅠ）和氣體Ⅱ（GSⅡ）分別設(shè)置為40 PSI 和10 PSI，離子源溫度為320 ℃。

1.3.5 代謝物的鑒定 將下機數(shù)據(jù)（.raw）文件導(dǎo)入CD 搜庫軟件（CD3.1，Thermo Fisher）中，根據(jù)代謝物保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)進行初步篩選，然后選擇保留時間偏差0.2 min 和質(zhì)量偏差5×10-6分別對不同甜橙果皮樣品進行峰對齊，以使代謝物鑒定可信度更高，并對各代謝物的峰面積分別進行相對定量分析，結(jié)合目標(biāo)離子，再次根據(jù)碎片離子和分子離子峰對甜橙果皮中各代謝物進行分子式預(yù)測并與mzCloud、mzVault、masslist 數(shù)據(jù)庫進行比較，利用空白樣本消除背景離子對試驗的影響，并對各代謝物的定量結(jié)果進行歸一化處理，最終得到甜橙果皮各樣品中代謝物的鑒定及定量結(jié)果。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用CD3.1 軟件處理本研究所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA） 和聚類分析分別對甜橙果實對照組（CK）和包裝組（PE）樣品進行差異代謝物分析。通過單因素分析確定的CK 和PE 組樣本間的差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）和q 值來篩選差異代謝物，以FC≥1.2 或≤0.8333，q 值<0.05 作為篩選差異代謝物的條件。通過R （v3.3.2）中pheatmap 程序?qū)Ω涕俟麑嵑职卟“l(fā)生過程中篩選出差異代謝成分進行聚類分析并繪制熱圖，并分別利用KEGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html） 和HMDB 數(shù)據(jù)庫（https：//hmdb.ca/metabolites）進行代謝物代謝通路注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 包裝對柑橘褐斑病指數(shù)的影響

由圖1可知，在甜橙果實貯藏期間，果皮褐斑指數(shù)隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，而PE 包裝處理甜橙果實在貯藏14 d 時，沒有發(fā)生褐斑病，說明PE 包裝處理可抑制甜橙果實褐斑病的發(fā)生。

圖1 PE 包裝對褐斑病指數(shù)的影響Fig.1 The effect of PE packaging treatment on brownspot index

2.2 代謝物差異篩選結(jié)果

基于北京諾禾致源科技股份有限公司自建代謝物數(shù)據(jù)庫及相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，將樣本下機質(zhì)譜文件導(dǎo)入CD 搜庫軟件中，對甜橙果皮褐斑病發(fā)病過程中的主要代謝物進行定性和定量分析。由表2可知，在甜橙果皮中共鑒定出1 191 種代謝化合物，在CK-42 d vs CK-0 d 樣本中共檢測到107 種顯著差異代謝物，其中顯著上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物分別為62 和45 種，而在PE-42 d vs CK-0 d 樣本中共檢測到124 種顯著差異代謝物，其中顯著上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物分別為65 種和59 種。這些結(jié)果說明，處于褐斑病不同程度的樣品中顯著上調(diào)和下調(diào)的代謝物數(shù)量存在一定的差異。

表2 代謝物差異篩選結(jié)果Table 2 Identification differential results of metabolites

2.3 PCA 結(jié)果

通過對CK-42 d vs CK-0 d 和PE-42 d vs CK-0 d 兩組樣本分別進行主成分分析，判斷褐斑病嚴重（CK-42 d）、褐斑病程度中等（PE-42 d）和無褐斑?。–K-0 d）各組樣本之間的分組之間和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。PCA 結(jié)果分析表明，2個處理的3 次重復(fù)在得分圖中分布較為分散，表明每個處理內(nèi)差異較大。在CK-42 d vs CK-0 d樣本中PC1 和PC2 的貢獻率分別為38.70%和20.28%，CK-42 d 和CK-0 d 兩組樣本間PCA 得分差異顯著并且相距較遠，并位于95%置信區(qū)間內(nèi)，說明CK-42 d vs CK-0 d 樣本間各代謝物存在較大的差異。在PE-42 d vs CK-0 d 樣本中PC1 和PC2 的貢獻率分別為35.28%和28.69%，PE-42 d vs CK-0 d 樣本間PCA 得分差異顯著且置于95%置信區(qū)間內(nèi)，說明PE-42 d vs CK-0 d 樣本間各代謝物也存在較大的差異。

圖2 兩組樣品的PCA 結(jié)果Fig.2 PCA results of two groups of samples

2.4 PLS-DA 結(jié)果

雖然PCA 分析法能夠有效地提取樣本主要信息，但是對樣本間相關(guān)性較小的變量不敏感，然而采用偏最小二乘法判別分析 （Partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）可以使各組樣本間的區(qū)分最大化，有助于探索差異代謝物。根據(jù)PLS-DA 模型（圖3a）對1 191 種代謝組數(shù)據(jù)進行分析，無褐斑病果皮樣品（CK-0 d）分布在置信區(qū)間的左側(cè)，褐斑病嚴重的果皮樣品分布在置信區(qū)間的右側(cè)，2 個樣品的區(qū)分效果豐常明顯。PLS-DA 得到2 個主成分，PC1 的貢獻率為35.14%、PC2 的貢獻率為23.73%，R2Y=1、Q2Y=0.57。無褐斑病果皮樣品（CK-0 d）分布在置信區(qū)間的左側(cè)，而褐斑中等程度果皮樣品（PE-42 d）分布在置信區(qū)間的右側(cè)，CK-0 d 與PE-42 d 區(qū)分效果明顯。PC1 的貢獻率為36.81%，PC2 的貢獻率為19.26%，R2Y=1、Q2Y=0.65（圖3b）。

圖3 PLS-DA 得分圖Fig.3 The score chart of PLS-DA

2.5 差異代謝物火山圖

根據(jù)投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）、FC 和P 值來篩選甜橙果實褐斑病發(fā)生過程中的差異代謝物。設(shè)定閾值為VIP >1.0，F(xiàn)C>1.2 或FC<0.833 且P<0.05。通過差異倍數(shù)分析（FC）和火山圖（圖4），可直接說明甜橙果實CK 和PE 樣本間代謝物的顯著性，進而得到差異代謝物。

圖4 正離子模式下的組間火山圖Fig.4 Volcano map of two groups of samples in positive ion mode

2.6 差異代謝物熱圖分析

為了方便了解甜橙褐斑病發(fā)生過程中代謝物的變化規(guī)律，對樣本中的顯著性差異代謝物進行歸一化處理，并制作聚類熱圖。圖5和圖6直觀、簡單地說明了柑橘褐斑病發(fā)生過程中代謝物的變化情況。在CK-42 d vs CK-0 d 樣本中，在107種具有顯著性差異的代謝物中，褐斑嚴重的果皮樣品（CK-42 d）相對無褐斑病果皮樣品（CK-0 d）有62 種代謝物顯著上調(diào)，即相對含量增加，增加的代謝物占107 種差異代謝物的57.94%，45 種代謝物顯著下調(diào)，包括橘皮素、槲皮素、脫氫二異丁香酚、4-乙基苯酚、糖苷、胍丁胺等代謝物，即相對含量降低，降低的代謝物占107 種差異代謝物的42.06%（圖5）。在PE-42 d vs CK-0 d 樣本中，篩選出124 種顯著性差異代謝物中，褐斑程度中等的果皮樣品（PE-42 d）相對無褐斑病果皮樣品（CK-0 d）有65 種代謝物顯著上調(diào)，即相對含量增加，增加的代謝物占124 種差異代謝物的52.42%，59 種代謝物顯著下調(diào)，即相對含量降低，降低的代謝物占124 種差異代謝物的47.58%（圖6）。

圖5 正離子模式代謝物聚類分析Fig.5 Cluster analysis of metabolites in positive ion mode

圖6 正離子模式代謝物聚類分析Fig.6 Cluster analysis of metabolites in positive ion mode

2.7 代謝物通路及分類注釋

2.7.1 KEGG 通路注釋 通過KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫對甜橙果實褐斑病發(fā)生過程中的代謝物進行通路注釋分析，結(jié)果顯示（圖7），甜橙褐斑果皮代謝物主要可分為3 大類：第1 類為環(huán)境信息加工（Environmental information processing），包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）和跨膜運輸（Membrane transport）2 個2 級分類，其中有3 種代謝物參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有10 種代謝物參與跨膜運輸途徑；第2 類為遺傳信息加工 （Genetic information processing），括翻譯（Translation）和折疊、分類及降解 （Folding，sorting and degradation）2 個2 級分類，其中有7 種代謝物參與翻譯途徑，有2 種代謝物參與折疊、分類及降解途徑；第3 類為新陳代謝（Metabolism），包括氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、其它次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of other secondary metabolites）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、脂肪酸代謝（Lipid metabolism）、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）等10 個2 級分類，其中有12 種代謝物參與核苷酸代謝通路，有42 種代謝物參與氨基酸代謝通路，有59 種代謝物參與其它次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路，有13 種代謝物參與碳水化合物代謝通路，有11 種代謝物參與脂肪酸代謝通路。

圖7 代謝物KEGG 富集圖Fig.7 Metabolite KEGG enrichment map

2.7.2 HMDB 分類注釋 通過Human Metabolome Database 數(shù)據(jù)庫對甜橙褐斑病發(fā)生過程中的代謝物進行HMDB 分類注釋結(jié)果（圖8）顯示，甜橙果實代謝物主要分布在11 條代謝途徑中，代謝物數(shù)量富集最多的前5 條通路分別是①苯丙烷和聚酮化合物通路 （Phenylpropanoids and polyketides），主要包括香檸檬素、檸檬酸甘油酯、四環(huán)素、表沒食子兒茶素、楊梅素、香豆酚、兒茶素等102 種代謝物；②脂質(zhì)和類脂質(zhì)類 （Lipids and lipid-like molecules），主要包括香芹酮、焦木酚E、11-氧代苯二酚、（+）-樟腦、單油精、瓦巴因等70 種代謝成分；③有機雜環(huán)化合物（Organoheterocyclic compounds），主要包括麥芽酚、硫胺素、鳥嘌呤、亞葉酸、間苯三酚、腺嘌呤、DL-色氨酸等65 種代謝成分；④有機酸及其衍生物 （Organic acids and derivatives），主要包括N8-乙酰亞精胺、N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸、半胱氨酰甘氨酸、脯氨酸、L-谷氨酸、D-絲氨酸、L-組氨酸等62 種代謝成分；⑤苯甲酸酯類（Benzenoids），主要包括4-苯基丁酸、4-甲氧基苯甲醛、對乙酰氨基酚、3-甲氧基苯甲醛、丁二酸、3,5-二甲氧基苯甲酸等46 種代謝成分。

圖8 代謝物的HMDB 分類注釋Fig.8 Metabolite HMDB enrichment map

3 討論

酚類物質(zhì)是果實中含量比較豐富的次生代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌等作用[12-14]，對降低人類多種疾病的發(fā)生率，抵御紫外線輻射[15]等方面具有良好的效果，其中類黃酮和酚酸是柑橘主要的酚類物質(zhì)。Wang 等[16]利用HPLC 技術(shù)鑒定出柑橘果實中5 種酚酸物質(zhì)和9 種類黃酮物質(zhì)。Abad-garcía 等[17]利用高效液相色譜法（HPLC）共鑒定出柑橘果汁中58 種酚類物質(zhì)?？梢姡肏PLC 鑒定的代謝物數(shù)量有限。隨著代謝組學(xué)在過去十年中的迅速發(fā)展以及質(zhì)譜儀器研發(fā)的進步，使得在生物樣品中同時檢測數(shù)千種代謝化合物成為可能[18]。Metlin 起源于表征已知代謝物的數(shù)據(jù)庫，目前發(fā)展成為用于鑒定已知和未知代謝物和其它化學(xué)實體的技術(shù)平臺，并且可以加快非靶向的代謝物的鑒定流程[19]。本研究利用非靶向的代謝組學(xué)技術(shù)對采后柑橘果實褐斑病發(fā)病過程中的代謝物進行了研究，以探索相關(guān)代謝化合物與褐斑病的相關(guān)性。在甜橙果皮組織中共檢測到1 191 種化合物，大部分代謝化合物不存在顯著性差異，只有少數(shù)代謝物存在顯著性差異，比如在褐斑病嚴重的果皮樣品（CK-42 d）相比無褐斑病果皮樣品中（CK-0 d），共檢測到107 種差異代謝物，其中62 種代謝物顯著上調(diào)，45 種代謝物顯著下調(diào)。Doppler 等[20]利用LC-MS 并結(jié)合非靶向的代謝組學(xué)技術(shù)在植物中鑒定出996 種代謝化合物。Vrhovsek 等[21]利用LC-MS 技術(shù)在水果中鑒定出113 種酚類化合物。可見，非靶向的代謝組學(xué)技術(shù)具有高效、鑒定化合物種類多、可信度高、適合大樣本分析的特點[6]。

本研究利用非靶向代謝組學(xué)在甜橙果實褐斑病發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)橘皮素、槲皮素、脫氫二異丁香酚、4-乙基苯酚、糖苷、胍丁胺等45 種代謝物顯著下調(diào)，表明這些酚類物質(zhì)可能與果皮褐斑病的發(fā)生密切相關(guān)。Li 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量隨著柑橘果實褐斑病程度的加深呈現(xiàn)出現(xiàn)下降的趨勢，并且與PPO、POD 的活性密切相關(guān)。柑橘果實在長期低溫貯藏中易發(fā)生冷害，加劇細胞膜脂質(zhì)過氧化，大量積累丙二醛產(chǎn)物，打破了細胞區(qū)域化分隔系統(tǒng)，造成細胞內(nèi)酚類物質(zhì)、PPO、POD 等從液泡內(nèi)溢出與外界發(fā)生接觸，加快了果皮酶促褐變的進程，使得果皮表現(xiàn)出褐斑病的癥狀[23]。這些研究表明，柑橘果皮褐斑病形成機制是一個復(fù)雜的過程，跟酚類物質(zhì)種類及含量、酶促褐變、冷害等諸多因素有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究利用非靶向代謝組學(xué)研究甜橙果實褐斑病發(fā)生過程中的代謝物差異。結(jié)果表明：PE 包裝顯著減少甜橙果實褐斑病發(fā)病癥狀，在樣品中共檢測到1 191 種差異離子，在CK-42 d vs CK-0 d 樣本中，共篩選出107 種顯著性差異代謝物，其中62 個為上調(diào)，橘皮素、槲皮素、脫氫二異丁香酚、4-乙基苯酚、糖苷、胍丁胺等45 種代謝物顯著下調(diào)，可能與褐斑病的發(fā)生密切相關(guān)。經(jīng)HMDB數(shù)據(jù)庫通路注釋，代謝物富集數(shù)量最多的前5 條通路分別是苯丙烷和聚酮化合物通路、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子有機雜環(huán)化合物、有機酸及其衍生物、苯甲酸酯類通路。本研究初步探究了柑橘果實褐斑病發(fā)生過程中的代謝物，所檢測到的代謝物可為柑橘果皮的功能研究及下一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。