劉佳 肖玉梅 曾令武 張耀剛 包紫薇 吳妹英

江蘇省蘇州市第五人民醫(yī)院，蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院肺科，蘇州 210000

由于艾滋病的流行、人口老齡化、環(huán)境問題和免疫抑制劑的使用等相關(guān)因素的影響， 近年來非結(jié)核分枝桿菌（NTM）致病率越來越高，在很多國家和地區(qū)已成為重要的公共衛(wèi)生問題之一[1-3]。NTM 病診斷困難且耐藥率高[2,4]，導(dǎo)致診療難度加大。目前常規(guī)運(yùn)用分枝桿菌培養(yǎng)法檢測NTM，雖然檢測費(fèi)用低，操作簡便，但檢測時(shí)間長，容易造成患者失訪，導(dǎo)致治療延誤。 隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，全基因測序可以快速檢測和鑒定NTM[5]，已被越來越多地應(yīng)用于臨床， 成為鑒定NTM 的另一項(xiàng) “金標(biāo)準(zhǔn)”[2,6-7]。 本研究利用第二代全基因測序法來分析蘇州地區(qū)NTM 病的菌種分布及流行趨勢(shì)，并通過基因進(jìn)化樹研究NTM 病是否存在人際間傳染的可能， 為今后合理地診療NTM 病提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集 2014年 1月至 2019年 1月就診于蘇州市第五人民醫(yī)院診斷為NTM 病患者信息， 包括性別、年齡、居住地、職業(yè)等，同時(shí)收集患者痰、肺泡灌洗液、腦脊液、尿沉渣、胸腹水等樣本，所有樣本均經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)提示陽性，同一患者相同樣本來源僅選取1 株。 另選取1例患者不同時(shí)期2 株菌株用于基因進(jìn)化樹中比對(duì)分析。 本研究通過蘇州市第五人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) [倫理審批號(hào)：(2021)院倫理審字（012）號(hào)]。

二、研究方法

1.分枝桿菌培養(yǎng)

在樣本瓶里加入等量的4%氫氧化鈉（NaOH）處理液，混勻；取5 mL 處理后樣本置入50 mL 已標(biāo)記的離心管中，放入振蕩器上強(qiáng)力渦旋振蕩30 min，混勻；在離心管中加入pH 6.8 PBS 緩沖液至40 mL后離心15 min，相對(duì)離心力2 572×g；倒去上清液，加入 1~2 mL 的 PBS 緩沖液，中和 pH 至 6.8。 樣本接種前， 在BBL MGIL 培養(yǎng)管中先加入營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)混合添加劑0.8 mL，抽取0.5 mL 已處理樣本注入MGIT 培養(yǎng)管中，將接種好的MGIT 培養(yǎng)管放入BACTEC MGIT 960 Tb 全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏儀（美國BD 公司）中培養(yǎng)。

2. DNA 提取及測序

使用核酸提取試劑盒進(jìn)行各類樣本中DNA 的提?。绹鳥D 公司MGIT 960 型全自動(dòng)分枝桿菌檢測儀），并進(jìn)行擴(kuò)增（杭州博日科技有限公司PCR 擴(kuò)增儀）。

將提取的DNA 外送行全基因測序 （杭州迪安檢測公司）， 具體方法如下：（1） 將 DNA 打斷成約400 bp 大小的片段， 在DNA 片段兩段加上一定序列的接頭，PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫的富集，Qubit 對(duì)純化后的文庫濃度進(jìn)行檢測， 用Agilent420 檢測文庫片段大小， 用 Q-PCR 檢測文庫的摩爾濃度；（2）用NaOH 進(jìn)行 DNA 文庫的變性， 產(chǎn)生 DNA 單鏈，用HT1 緩沖液將變性后的文庫進(jìn)行稀釋至上機(jī)濃度；（3）IlluminaRNextseq 測序儀 （美國 Illumina 公司）進(jìn)行測序。

3. 全基因組共線性分析

對(duì)2 組同源性100%的菌株進(jìn)一步行全基因組共線分析。使用MUMmer 軟件（Version 3.23）進(jìn)行菌株比對(duì)，確定基因組間的大范圍共線性關(guān)系，共線范圍大，親緣性更近。 使用 LASTZ（Version 1.03.54）對(duì)區(qū)域間進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)局部位置排列關(guān)系，并從中查找易位、倒置、易位+倒置的區(qū)域，菌株間發(fā)生更少的易位、倒置，進(jìn)化關(guān)系尺度更小。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用描述性流行病學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用表示， 計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)、株數(shù)和率表示。

結(jié) 果

一、流行特征

共收集到NTM 病患者67例，其中2014—2018年64例。2014—2018年不同年份NTM 病的分布情況詳見表1，表中可見檢出數(shù)逐年增多，總體上女性多于男性，農(nóng)村多于城市，職員發(fā)病率較少，基礎(chǔ)疾病以合并糖尿病較常見。

表1 蘇州地區(qū)2014—2018年非結(jié)核分枝桿菌病患者分布情況（n=64）

二、不同檢測方法結(jié)果對(duì)比

67 株NTM 菌株均采用全基因測序法檢測、傳統(tǒng)分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)合PCR 芯片技術(shù)檢測。全基因測序法檢測結(jié)果有胞內(nèi)分枝桿菌38 株（56.7%），堪薩斯分枝桿菌 13 株 （19.4%）， 膿腫分枝桿菌 10 株（14.9%），鳥分枝桿菌 5 株（7.5%），草分枝桿菌 1 株（1.5%）。 傳統(tǒng)檢測法顯示有59 株菌種與全基因測序法一致，另有8 株結(jié)果不同，全基因測序法與傳統(tǒng)檢驗(yàn)法的診斷一致率達(dá)88.06%（59/67）。

三、基因進(jìn)化樹分析

68 株（含 1例患者不同時(shí)期 2 株菌株）NTM 菌株基因進(jìn)化樹分析見圖1。 圖1 顯示有2 組菌株同源性均為100%，分別是SZWY1 和SZWY2（同一患者不同時(shí)期菌株）、SZWY5 和SZWY65（不同患者菌株）； 堪薩斯分枝桿菌菌株間的同源性高于胞內(nèi)分枝桿菌菌株間、鳥分枝桿菌菌株間、膿腫分枝桿菌菌株間的同源性。

圖1 68 株非結(jié)核分枝桿菌菌株基因進(jìn)化樹

對(duì)2 組同源性100%的菌株進(jìn)行全基因組共線分析發(fā)現(xiàn)：SZWY1 和SZWY2 的共線性范圍明顯大于SZWY5 和SZWY65，且兩組的變異均以易位基因?yàn)橹鳌?同一患者的共線范圍大于不同患者，親緣性更近，菌株間發(fā)生更少的易位、倒置，進(jìn)化關(guān)系尺度更小，保留更多的保守區(qū)域，同一患者體內(nèi)不同時(shí)期的菌株，更支持內(nèi)源性復(fù)燃。

討 論

NTM 具有地域性分布特征，好發(fā)于我國南方沿海地區(qū)[8-9]，據(jù)報(bào)道我國華北、東北地區(qū)NTM 菌株以胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌為主[8]。 本研究統(tǒng)計(jì)共發(fā)現(xiàn)蘇州地區(qū)有5 種NTM 菌種： 分別為胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、草分枝桿菌，以胞內(nèi)分枝桿菌為主，與既往本地區(qū)研究結(jié)果一致[8]。

目前尚無研究支持NTM 人與人之間具有傳染性。 本研究利用全基因測序結(jié)果，構(gòu)建基因進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)分枝桿菌菌株間、鳥分枝桿菌菌株間、膿腫分枝桿菌菌株間同源性總體偏低，暫不支持人際傳播，但本文發(fā)現(xiàn)堪薩斯分枝桿菌菌株之間同源性總體偏高， 不排除有傳染性可能。 同一患者相隔2年提供的菌株分析顯示，NTM 在人體內(nèi)的變異較慢，考慮內(nèi)源性復(fù)燃。 另外發(fā)現(xiàn)2 株菌株同源性為100%， 查閱2 株菌株來源患者的臨床資料， 顯示SZWY5 株來源患者為男性，60歲， 蘇州園區(qū)人，無業(yè)，SZWY65 株來源患者為女性，74歲，蘇州相城區(qū)人，農(nóng)民，患者間無親屬關(guān)系，無明確接觸史，有待搜集更多的臨床資料做進(jìn)一步驗(yàn)證。 本文共線性分析說明同一患者不同菌株和不同患者不同菌株同源性雖為100%，但共線性范圍不同，同一患者比不同患者的親緣性更近。

綜上，隨著近來對(duì)NTM 的重視，全基因測序法將會(huì)越來越多地用于NTM 的診療，NTM 患者的遺傳學(xué)信息和基因變異信息也將趨于明朗[9]，以期為今后的臨床診療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉佳、吳妹英：直接參與、文章撰寫、工作支持；肖玉梅、曾令武：文章撰寫、工作支持；張耀剛：直接參與；包紫薇：直接參與、工作支持