崔承遠

北大荒完達山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078

0 引言

膽固醇，別稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，其廣泛存在于動物體內(nèi)，尤以腦及神經(jīng)組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量較高，其溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙醚等溶劑，是動物組織、細胞所不可缺少的重要物質(zhì)。

膽固醇在人體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當其過量時便會導致高膽固醇血癥，對機體產(chǎn)生不利的影響?，F(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥、高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性。如果是單純的膽固醇高，則飲食調(diào)節(jié)是最好的辦法；若還伴有高血壓等癥狀，則需要同時使用降壓藥物。因此，膽固醇雖然不是嬰幼兒配方奶粉及成人奶粉中的必檢項目，但對于其含量卻同樣需要進行相應的監(jiān)測。

本檢測方法相比于目前檢測食品中膽固醇所常用的方法——《GB5009.128—2016食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》中第一法氣相色譜法而言，具有操作更便捷，耗時相對更短等優(yōu)勢，可以在一定程度上提高實驗室工作效率。

1 材料與方法

1.1 試劑

無水乙醇（C2H6O），體積分數(shù)為95%，分析純；正己烷（C6H14），色譜純；石油醚，沸程30～60 ℃，分析純，氫氧化鉀（NaOH），分析純；無水硫酸鈉（Na2SO4），分析純；膽固醇標準物質(zhì)，純度＞99%。

1.2 溶液配制

氫氧化鉀溶液（666.7 g/L）：稱取氫氧化鉀200 g于500 mL燒杯中，用無水乙醇定容。

膽固醇標準物質(zhì)儲備液（1.0mg/mL）：稱取膽固醇標準物質(zhì)100 mg（精確至0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用正己烷定容，混勻。此為濃度為1.0 mg/mL的膽固醇標準物質(zhì)儲備液。

膽固醇標準物質(zhì)中間液（0.010mg/mL）：準確移取1.0 mL膽固醇標準物質(zhì)儲備液于100 mL容量瓶內(nèi)，用正己烷定容，混勻。此為濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標準物質(zhì)中間液。

1.3 儀器設備及參數(shù)

1.3.1 儀器設備

氣相色譜儀（配置有FID氫火焰離子化檢測器），美國珀金埃爾默公司；電子天平（感量為0.1mg），山東博科科學儀器有限公司；平行濃縮儀，睿科集團股份有限公司；超聲波振蕩儀，昆山潔力美超聲儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器，唐山力辰科技有限公司；分液漏斗（125 mL），天津天?？萍及l(fā)展有限公司。

1.3.2 氣相色譜儀參數(shù)設置

進樣口溫度：300 ℃；檢測器溫度：300 ℃；分流比：10:1；進樣量：1.0 μL；色譜柱：型號DM-35石英毛細管柱，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25μm；程序升溫：如表1所示；輔助氣體：氫氣45 mL/min、空氣450 mL/min；載氣：高純氮氣1.0 mL/min。

表1 程序升溫條件

2 分析步驟

2.1 試樣處理

2.1.1 試樣皂化

稱取奶粉試樣（不含淀粉）1 g（精確至0.0001 g）于38 mL具四氟乙烯螺紋帽玻璃試管中，先后加入5 mL95%乙醇溶液及10 mL氫氧化鉀溶液，擰緊瓶蓋，將試管置于恒溫磁力攪拌器內(nèi)以（100±5）℃水浴皂化反應1 h[1]。

2.1.2 組分提取

水浴結(jié)束后將樣液冷卻至室溫，以少量水將試管內(nèi)樣液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗內(nèi)，加入25 mL石油醚萃取2～3 min[2]。將下層水相轉(zhuǎn)移至另一只125 mL分液漏斗中，加入25 mL石油醚再次萃取2～3 min。合并兩次提取液，以超純水沖洗提取液直至呈現(xiàn)中性[3]。

2.1.3 濃縮定容

將提取液通過無水硫酸鈉過濾至250 mL雞心瓶內(nèi)，并以石油醚沖洗分液漏斗及過濾漏斗，將沖洗液與提取液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸發(fā)濃縮至近干。用正己烷將雞心瓶內(nèi)樣液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶內(nèi)，以正己烷定容，混勻[4]。此為膽固醇樣液，氣相色譜儀待測[5]。

2.2 標準曲線制作

分別吸取濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標準物質(zhì)中間液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、10.0 mL和50.0 mL于6 支10 mL容量瓶內(nèi)，以正己烷定容，混勻，此為濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL及50 μg/mL的膽固醇系列標準物質(zhì)工作液。

將稀釋好的膽固醇標準系列工作液分別注入到氣相色譜儀中，得到每個濃度的膽固醇標準物質(zhì)工作液所對應的響應值（峰面積）和圖譜。

以膽固醇響應值（峰面積）為縱坐標，膽固醇的質(zhì)量為橫坐標繪制膽固醇標準物質(zhì)曲線，得到膽固醇回歸方程。

2.3 試樣溶液的測定

相同條件下，將樣品溶液分別引入氣相色譜儀進行測定。根據(jù)回歸方程計算出樣品中膽固醇的濃度。

2.4 分析結(jié)果的表述

試樣中膽固醇含量按式（1）計算：

式中：X-試樣中膽固醇的含量，單位為毫克每千克（mg/100g）；Cs-從標準曲線中得到試樣測定膽固醇的質(zhì)量含量，單位為毫克（mg）；m-試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；fi-試樣測定液稀釋倍數(shù)；100-換算系數(shù)。計算結(jié)果保留至小數(shù)點后一位。

2.5 方法特性參數(shù)驗證

2.5.1 線性范圍

稱取膽固醇標準物質(zhì)0.1000 g，按照膽固醇標準物質(zhì)溶液曲線方程制作的操作步驟進行操作。分別配制6 個濃度點，每個濃度點平行運行3 次，得到18 個濃度點所對應的響應值（峰面積）[6]。如表2所示。

表2 膽固醇標準物質(zhì)工作液濃度及響應值（峰面積）對應表

應用上述18 個標準物質(zhì)工作液所對應的響應值/峰面積及對應的碘質(zhì)量擬合曲線方程，得到膽固醇標準物質(zhì)曲線方程為：

膽固醇標準物質(zhì)曲線圖如圖1所示。從試驗結(jié)果可見，標準曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)大于0.99，濃度范圍覆蓋關(guān)注濃度的0%～150%。

圖1 膽固醇標準物質(zhì)曲線圖

2.5.2 方法檢出限與定量限

采用空白標準偏差法，選擇脫脂奶粉樣品，稱取10 份，每份稱取1 g，按照標準方法進行試樣預處理，并對最終樣液進行10 倍稀釋，用于膽固醇方法檢出限的測定。并通過氣相色譜分析得出圖譜及各自響應值（峰面積）。

參考《GB 5009.128—2016食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》中第一法氣相色譜法中膽固醇的檢出限0.3 mg/100 g，其對應的檢出濃度為0.3 μg/mL。本方法按照該檢出濃度，以脫脂奶粉作為空白本底試樣，加入適量膽固醇標準物質(zhì)，使其最終理論濃度0.3 μg/mL。并按照上述2.1進行10 平行試驗，10 次檢測結(jié)果及方法檢出限及定量限詳見表3。

由表3得出，膽固醇的方法檢測限（LOD）=0.08 mg/100 g，膽固醇的方法定量限（LOQ）=0.24 mg/100 g。

表3 膽固醇方法檢出限與定量限結(jié)果 單位：mg/100g

2.5.3 精密度

選擇成人奶粉樣品，進行10 平行試驗，按照上述所描述的操作步驟進行試樣前處理和測定，并應用上述方法檢出限所應用的標準物質(zhì)線性方程進行批處理及計算[7]。試驗結(jié)果詳見表4。

表4 膽固醇精密度試驗結(jié)果

2.5.4 正確度

選擇脫脂奶粉樣品作為本底試樣，分別進行3 水平6 平行加標回收率試驗，即正確度試驗。3 水平加標濃度分別為低濃度、中濃度和高濃度，其中低濃度加標回收率試驗按照上述試驗所得方法檢出限，即0.08 mg/100 g本底含量的0.5倍進行加標，中濃度加標回收率試驗按照本底含量的1.0 倍進行加標，高低濃度加標回收率試驗按照本底含量的1.5 倍進行加標[8]。試樣處理過程按照《GB 5009.128—2016 食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》執(zhí)行。加標含量及回收率詳見表5。

表5 膽固醇正確度試驗結(jié)果

經(jīng)計算，膽固醇3 水平6 平行共計18 個加標回收率試驗，結(jié)果在91.1%～110%之間。

3 結(jié)論

經(jīng)線性范圍、方法檢出限、精密度和正確度方法特性參數(shù)的驗證，得出膽固醇的方法檢出限為0.08 mg/100 g，方法定量限為0.24 mg/100 g，精密度為2.03%，3 水平6 平行正確度試驗加標回收率在91.1%～110%范圍內(nèi)，均滿足《GB/T 27417—2017合格評定 化學分析方法確認和驗證指南附錄A》的要求。