崔承遠(yuǎn)
北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司,黑龍江哈爾濱 150078
膽固醇,別稱(chēng)膽甾醇,是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物,其廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi),尤以腦及神經(jīng)組織中最為豐富,在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量較高,其溶解性與脂肪類(lèi)似,不溶于水,易溶于乙醚等溶劑,是動(dòng)物組織、細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)。
膽固醇在人體內(nèi)有著廣泛的生理作用,但當(dāng)其過(guò)量時(shí)便會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥、高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性。如果是單純的膽固醇高,則飲食調(diào)節(jié)是最好的辦法;若還伴有高血壓等癥狀,則需要同時(shí)使用降壓藥物。因此,膽固醇雖然不是嬰幼兒配方奶粉及成人奶粉中的必檢項(xiàng)目,但對(duì)于其含量卻同樣需要進(jìn)行相應(yīng)的監(jiān)測(cè)。
本檢測(cè)方法相比于目前檢測(cè)食品中膽固醇所常用的方法——《GB5009.128—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定》中第一法氣相色譜法而言,具有操作更便捷,耗時(shí)相對(duì)更短等優(yōu)勢(shì),可以在一定程度上提高實(shí)驗(yàn)室工作效率。
無(wú)水乙醇(C2H6O),體積分?jǐn)?shù)為95%,分析純;正己烷(C6H14),色譜純;石油醚,沸程30~60 ℃,分析純,氫氧化鉀(NaOH),分析純;無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4),分析純;膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),純度>99%。
氫氧化鉀溶液(666.7 g/L):稱(chēng)取氫氧化鉀200 g于500 mL燒杯中,用無(wú)水乙醇定容。
膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液(1.0mg/mL):稱(chēng)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100 mg(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中,用正己烷定容,混勻。此為濃度為1.0 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。
膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液(0.010mg/mL):準(zhǔn)確移取1.0 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶?jī)?nèi),用正己烷定容,混勻。此為濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液。
1.3.1 儀器設(shè)備
氣相色譜儀(配置有FID氫火焰離子化檢測(cè)器),美國(guó)珀金埃爾默公司;電子天平(感量為0.1mg),山東博科科學(xué)儀器有限公司;平行濃縮儀,??萍瘓F(tuán)股份有限公司;超聲波振蕩儀,昆山潔力美超聲儀器有限公司;恒溫磁力攪拌器,唐山力辰科技有限公司;分液漏斗(125 mL),天津天??萍及l(fā)展有限公司。
1.3.2 氣相色譜儀參數(shù)設(shè)置
進(jìn)樣口溫度:300 ℃;檢測(cè)器溫度:300 ℃;分流比:10:1;進(jìn)樣量:1.0 μL;色譜柱:型號(hào)DM-35石英毛細(xì)管柱,柱長(zhǎng)30 m,內(nèi)徑0.25 mm,膜厚0.25μm;程序升溫:如表1所示;輔助氣體:氫氣45 mL/min、空氣450 mL/min;載氣:高純氮?dú)?.0 mL/min。
表1 程序升溫條件
2.1.1 試樣皂化
稱(chēng)取奶粉試樣(不含淀粉)1 g(精確至0.0001 g)于38 mL具四氟乙烯螺紋帽玻璃試管中,先后加入5 mL95%乙醇溶液及10 mL氫氧化鉀溶液,擰緊瓶蓋,將試管置于恒溫磁力攪拌器內(nèi)以(100±5)℃水浴皂化反應(yīng)1 h[1]。
2.1.2 組分提取
水浴結(jié)束后將樣液冷卻至室溫,以少量水將試管內(nèi)樣液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗內(nèi),加入25 mL石油醚萃取2~3 min[2]。將下層水相轉(zhuǎn)移至另一只125 mL分液漏斗中,加入25 mL石油醚再次萃取2~3 min。合并兩次提取液,以超純水沖洗提取液直至呈現(xiàn)中性[3]。
2.1.3 濃縮定容
將提取液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾至250 mL雞心瓶?jī)?nèi),并以石油醚沖洗分液漏斗及過(guò)濾漏斗,將沖洗液與提取液合并,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸發(fā)濃縮至近干。用正己烷將雞心瓶?jī)?nèi)樣液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶?jī)?nèi),以正己烷定容,混勻[4]。此為膽固醇樣液,氣相色譜儀待測(cè)[5]。
分別吸取濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、10.0 mL和50.0 mL于6 支10 mL容量瓶?jī)?nèi),以正己烷定容,混勻,此為濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL及50 μg/mL的膽固醇系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。
將稀釋好的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入到氣相色譜儀中,得到每個(gè)濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值(峰面積)和圖譜。
以膽固醇響應(yīng)值(峰面積)為縱坐標(biāo),膽固醇的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線,得到膽固醇回歸方程。
相同條件下,將樣品溶液分別引入氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品中膽固醇的濃度。
試樣中膽固醇含量按式(1)計(jì)算:
式中:X-試樣中膽固醇的含量,單位為毫克每千克(mg/100g);Cs-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到試樣測(cè)定膽固醇的質(zhì)量含量,單位為毫克(mg);m-試樣的質(zhì)量,單位為克(g);fi-試樣測(cè)定液稀釋倍數(shù);100-換算系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。
2.5.1 線性范圍
稱(chēng)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1000 g,按照膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液曲線方程制作的操作步驟進(jìn)行操作。分別配制6 個(gè)濃度點(diǎn),每個(gè)濃度點(diǎn)平行運(yùn)行3 次,得到18 個(gè)濃度點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值(峰面積)[6]。如表2所示。
表2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液濃度及響應(yīng)值(峰面積)對(duì)應(yīng)表
應(yīng)用上述18 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值/峰面積及對(duì)應(yīng)的碘質(zhì)量擬合曲線方程,得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線方程為:
膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖如圖1所示。從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)大于0.99,濃度范圍覆蓋關(guān)注濃度的0%~150%。
圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖
2.5.2 方法檢出限與定量限
采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法,選擇脫脂奶粉樣品,稱(chēng)取10 份,每份稱(chēng)取1 g,按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行試樣預(yù)處理,并對(duì)最終樣液進(jìn)行10 倍稀釋?zhuān)糜谀懝檀挤椒z出限的測(cè)定。并通過(guò)氣相色譜分析得出圖譜及各自響應(yīng)值(峰面積)。
參考《GB 5009.128—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定》中第一法氣相色譜法中膽固醇的檢出限0.3 mg/100 g,其對(duì)應(yīng)的檢出濃度為0.3 μg/mL。本方法按照該檢出濃度,以脫脂奶粉作為空白本底試樣,加入適量膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),使其最終理論濃度0.3 μg/mL。并按照上述2.1進(jìn)行10 平行試驗(yàn),10 次檢測(cè)結(jié)果及方法檢出限及定量限詳見(jiàn)表3。
由表3得出,膽固醇的方法檢測(cè)限(LOD)=0.08 mg/100 g,膽固醇的方法定量限(LOQ)=0.24 mg/100 g。
表3 膽固醇方法檢出限與定量限結(jié)果 單位:mg/100g
2.5.3 精密度
選擇成人奶粉樣品,進(jìn)行10 平行試驗(yàn),按照上述所描述的操作步驟進(jìn)行試樣前處理和測(cè)定,并應(yīng)用上述方法檢出限所應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性方程進(jìn)行批處理及計(jì)算[7]。試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表4。
表4 膽固醇精密度試驗(yàn)結(jié)果
2.5.4 正確度
選擇脫脂奶粉樣品作為本底試樣,分別進(jìn)行3 水平6 平行加標(biāo)回收率試驗(yàn),即正確度試驗(yàn)。3 水平加標(biāo)濃度分別為低濃度、中濃度和高濃度,其中低濃度加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照上述試驗(yàn)所得方法檢出限,即0.08 mg/100 g本底含量的0.5倍進(jìn)行加標(biāo),中濃度加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照本底含量的1.0 倍進(jìn)行加標(biāo),高低濃度加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照本底含量的1.5 倍進(jìn)行加標(biāo)[8]。試樣處理過(guò)程按照《GB 5009.128—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定》執(zhí)行。加標(biāo)含量及回收率詳見(jiàn)表5。
表5 膽固醇正確度試驗(yàn)結(jié)果
經(jīng)計(jì)算,膽固醇3 水平6 平行共計(jì)18 個(gè)加標(biāo)回收率試驗(yàn),結(jié)果在91.1%~110%之間。
經(jīng)線性范圍、方法檢出限、精密度和正確度方法特性參數(shù)的驗(yàn)證,得出膽固醇的方法檢出限為0.08 mg/100 g,方法定量限為0.24 mg/100 g,精密度為2.03%,3 水平6 平行正確度試驗(yàn)加標(biāo)回收率在91.1%~110%范圍內(nèi),均滿足《GB/T 27417—2017合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南附錄A》的要求。