崔承遠(yuǎn)

北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078

0 引言

膽固醇，別稱(chēng)膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，其廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，尤以腦及神經(jīng)組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量較高，其溶解性與脂肪類(lèi)似，不溶于水，易溶于乙醚等溶劑，是動(dòng)物組織、細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)。

膽固醇在人體內(nèi)有著廣泛的生理作用，但當(dāng)其過(guò)量時(shí)便會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥、高膽固醇血癥有密切的相關(guān)性。如果是單純的膽固醇高，則飲食調(diào)節(jié)是最好的辦法；若還伴有高血壓等癥狀，則需要同時(shí)使用降壓藥物。因此，膽固醇雖然不是嬰幼兒配方奶粉及成人奶粉中的必檢項(xiàng)目，但對(duì)于其含量卻同樣需要進(jìn)行相應(yīng)的監(jiān)測(cè)。

本檢測(cè)方法相比于目前檢測(cè)食品中膽固醇所常用的方法——《GB5009.128—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定》中第一法氣相色譜法而言，具有操作更便捷，耗時(shí)相對(duì)更短等優(yōu)勢(shì)，可以在一定程度上提高實(shí)驗(yàn)室工作效率。

1 材料與方法

1.1 試劑

無(wú)水乙醇（C2H6O），體積分?jǐn)?shù)為95%，分析純；正己烷（C6H14），色譜純；石油醚，沸程30～60 ℃，分析純，氫氧化鉀（NaOH），分析純；無(wú)水硫酸鈉（Na2SO4），分析純；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度＞99%。

1.2 溶液配制

氫氧化鉀溶液（666.7 g/L）：稱(chēng)取氫氧化鉀200 g于500 mL燒杯中，用無(wú)水乙醇定容。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL）：稱(chēng)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100 mg（精確至0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用正己烷定容，混勻。此為濃度為1.0 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液（0.010mg/mL）：準(zhǔn)確移取1.0 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，用正己烷定容，混勻。此為濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液。

1.3 儀器設(shè)備及參數(shù)

1.3.1 儀器設(shè)備

氣相色譜儀（配置有FID氫火焰離子化檢測(cè)器），美國(guó)珀金埃爾默公司；電子天平（感量為0.1mg），山東博科科學(xué)儀器有限公司；平行濃縮儀，?？萍瘓F(tuán)股份有限公司；超聲波振蕩儀，昆山潔力美超聲儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器，唐山力辰科技有限公司；分液漏斗（125 mL），天津天?？萍及l(fā)展有限公司。

1.3.2 氣相色譜儀參數(shù)設(shè)置

進(jìn)樣口溫度：300 ℃；檢測(cè)器溫度：300 ℃；分流比：10:1；進(jìn)樣量：1.0 μL；色譜柱：型號(hào)DM-35石英毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25μm；程序升溫：如表1所示；輔助氣體：氫氣45 mL/min、空氣450 mL/min；載氣：高純氮?dú)?.0 mL/min。

表1 程序升溫條件

2 分析步驟

2.1 試樣處理

2.1.1 試樣皂化

稱(chēng)取奶粉試樣（不含淀粉）1 g（精確至0.0001 g）于38 mL具四氟乙烯螺紋帽玻璃試管中，先后加入5 mL95%乙醇溶液及10 mL氫氧化鉀溶液，擰緊瓶蓋，將試管置于恒溫磁力攪拌器內(nèi)以（100±5）℃水浴皂化反應(yīng)1 h[1]。

2.1.2 組分提取

水浴結(jié)束后將樣液冷卻至室溫，以少量水將試管內(nèi)樣液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗內(nèi)，加入25 mL石油醚萃取2～3 min[2]。將下層水相轉(zhuǎn)移至另一只125 mL分液漏斗中，加入25 mL石油醚再次萃取2～3 min。合并兩次提取液，以超純水沖洗提取液直至呈現(xiàn)中性[3]。

2.1.3 濃縮定容

將提取液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾至250 mL雞心瓶?jī)?nèi)，并以石油醚沖洗分液漏斗及過(guò)濾漏斗，將沖洗液與提取液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸發(fā)濃縮至近干。用正己烷將雞心瓶?jī)?nèi)樣液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶?jī)?nèi)，以正己烷定容，混勻[4]。此為膽固醇樣液，氣相色譜儀待測(cè)[5]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別吸取濃度為0.010 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL、10.0 mL和50.0 mL于6 支10 mL容量瓶?jī)?nèi)，以正己烷定容，混勻，此為濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL及50 μg/mL的膽固醇系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

將稀釋好的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入到氣相色譜儀中，得到每個(gè)濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值（峰面積）和圖譜。

以膽固醇響應(yīng)值（峰面積）為縱坐標(biāo)，膽固醇的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線，得到膽固醇回歸方程。

2.3 試樣溶液的測(cè)定

相同條件下，將樣品溶液分別引入氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品中膽固醇的濃度。

2.4 分析結(jié)果的表述

試樣中膽固醇含量按式（1）計(jì)算：

式中：X-試樣中膽固醇的含量，單位為毫克每千克（mg/100g）；Cs-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到試樣測(cè)定膽固醇的質(zhì)量含量，單位為毫克（mg）；m-試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；fi-試樣測(cè)定液稀釋倍數(shù)；100-換算系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。

2.5 方法特性參數(shù)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍

稱(chēng)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1000 g，按照膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液曲線方程制作的操作步驟進(jìn)行操作。分別配制6 個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)平行運(yùn)行3 次，得到18 個(gè)濃度點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值（峰面積）[6]。如表2所示。

表2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液濃度及響應(yīng)值（峰面積）對(duì)應(yīng)表

應(yīng)用上述18 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值/峰面積及對(duì)應(yīng)的碘質(zhì)量擬合曲線方程，得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線方程為：

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖如圖1所示。從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)大于0.99，濃度范圍覆蓋關(guān)注濃度的0%～150%。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖

2.5.2 方法檢出限與定量限

采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法，選擇脫脂奶粉樣品，稱(chēng)取10 份，每份稱(chēng)取1 g，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行試樣預(yù)處理，并對(duì)最終樣液進(jìn)行10 倍稀釋?zhuān)糜谀懝檀挤椒z出限的測(cè)定。并通過(guò)氣相色譜分析得出圖譜及各自響應(yīng)值（峰面積）。

參考《GB 5009.128—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定》中第一法氣相色譜法中膽固醇的檢出限0.3 mg/100 g，其對(duì)應(yīng)的檢出濃度為0.3 μg/mL。本方法按照該檢出濃度，以脫脂奶粉作為空白本底試樣，加入適量膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使其最終理論濃度0.3 μg/mL。并按照上述2.1進(jìn)行10 平行試驗(yàn)，10 次檢測(cè)結(jié)果及方法檢出限及定量限詳見(jiàn)表3。

由表3得出，膽固醇的方法檢測(cè)限（LOD）=0.08 mg/100 g，膽固醇的方法定量限（LOQ）=0.24 mg/100 g。

表3 膽固醇方法檢出限與定量限結(jié)果 單位：mg/100g

2.5.3 精密度

選擇成人奶粉樣品，進(jìn)行10 平行試驗(yàn)，按照上述所描述的操作步驟進(jìn)行試樣前處理和測(cè)定，并應(yīng)用上述方法檢出限所應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性方程進(jìn)行批處理及計(jì)算[7]。試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 膽固醇精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 正確度

選擇脫脂奶粉樣品作為本底試樣，分別進(jìn)行3 水平6 平行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，即正確度試驗(yàn)。3 水平加標(biāo)濃度分別為低濃度、中濃度和高濃度，其中低濃度加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照上述試驗(yàn)所得方法檢出限，即0.08 mg/100 g本底含量的0.5倍進(jìn)行加標(biāo)，中濃度加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照本底含量的1.0 倍進(jìn)行加標(biāo)，高低濃度加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照本底含量的1.5 倍進(jìn)行加標(biāo)[8]。試樣處理過(guò)程按照《GB 5009.128—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測(cè)定》執(zhí)行。加標(biāo)含量及回收率詳見(jiàn)表5。

表5 膽固醇正確度試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算，膽固醇3 水平6 平行共計(jì)18 個(gè)加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果在91.1%～110%之間。

3 結(jié)論

經(jīng)線性范圍、方法檢出限、精密度和正確度方法特性參數(shù)的驗(yàn)證，得出膽固醇的方法檢出限為0.08 mg/100 g，方法定量限為0.24 mg/100 g，精密度為2.03%，3 水平6 平行正確度試驗(yàn)加標(biāo)回收率在91.1%～110%范圍內(nèi)，均滿足《GB/T 27417—2017合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南附錄A》的要求。