何 瑛，紀(jì)坤發(fā)，楊美豐，楊愛君，羅少杰，曹學(xué)思

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510507

0 引言

牛奶中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，被稱為“白色血液”，是為數(shù)不多的全價(jià)食品之一，也是微生物生長繁殖的良好培養(yǎng)基。生乳中含有大腸桿菌、沙門氏菌等病源微生物和腐敗菌，為了保證牛奶的飲用安全并延長貨架期，在加工過程中需要對生乳進(jìn)行殺菌處理。熱處理是乳制品加工中最常用的殺菌工藝[1]，適宜的熱處理還可以使不易吸收的大分子蛋白質(zhì)降解成人體易于消化吸收的小分子蛋白質(zhì)，提高牛奶的營養(yǎng)價(jià)值。但是，過度的熱處理會使牛奶中的蛋白質(zhì)、乳糖等發(fā)生不同程度的物理及化學(xué)變化，如美拉德反應(yīng)、乳糖異構(gòu)化以及蛋白質(zhì)變性等，使牛奶的感官和營養(yǎng)價(jià)值下降，甚至產(chǎn)生有害物質(zhì)，隨著熱處理強(qiáng)度的增加，有害物質(zhì)的含量也會不同程度地增加[2]。因此，在保證牛奶衛(wèi)生安全的前提下，降低對其營養(yǎng)物質(zhì)的損傷是熱處理工藝的控制要點(diǎn)。然而，目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)中尚未有對各種熱處理工藝的規(guī)范和指導(dǎo)，對生乳熱處理強(qiáng)度的評價(jià)以及熱敏感指標(biāo)的篩選就顯得尤為重要。2013年，原農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估試驗(yàn)室向國家建議實(shí)施優(yōu)質(zhì)乳工程，通過對國產(chǎn)奶和進(jìn)口奶進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)的比較評估，確定牛奶中糠氨酸可以作為品質(zhì)高低的標(biāo)記物。

糠氨酸（ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸），又稱“呋喃素”，是美拉德反應(yīng)初期產(chǎn)生的阿姆瑞德（Amadori）化合物酸水解產(chǎn)生的穩(wěn)定產(chǎn)物[3]，其在牛奶中的含量很大程度取決于對牛奶的熱處理強(qiáng)度和儲存條件，可以很好地體現(xiàn)牛奶美拉德反應(yīng)的程度[4]。早在1992年，歐盟各國政府便將糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評價(jià)液態(tài)乳品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。此外，歐盟和國際乳品聯(lián)合會分別于1996年和1998年提出以糠氨酸和乳果糖作為衡量復(fù)原乳的標(biāo)志物[5]，我國原農(nóng)業(yè)部也在2005年發(fā)布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)將巴氏奶、超高溫滅菌乳中的糠氨酸含量作為判定是否為復(fù)原乳的因素之一[6]。

目前，牛奶中糠氨酸的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC）、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）、毛細(xì)管色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（CE-MS/MS）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）、穩(wěn)定同位素稀釋-質(zhì)譜聯(lián)用法和表面熒光光譜法等[3，7，8]。其中，質(zhì)譜法雖然分離度較高，但儀器昂貴、維護(hù)成本高、對操作人員的要求也較高；表面熒光光譜法靈敏度較低，一般用于半定量分析[8]；高效液相色譜法是使用最早且應(yīng)用最廣的檢測方法，國際乳品聯(lián)合會（IDF）標(biāo)準(zhǔn)ISO 18329—2012[9]和我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 939—2016 巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》[6]中使用的檢測方法均為高效液相色譜法，其具有高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、儀器普遍率高、維護(hù)成本較低等優(yōu)勢。本文主要通過從色譜柱、流動相和酸水解條件等方面對NY/T 939-2016進(jìn)行研究，建立使用高效液相色譜來測定牛奶中糠氨酸含量的方法，為乳品企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1200），美國Agilent公司；凱氏定氮儀（FOSS KJELTEC 8100），丹麥FOSS公司；十萬分之一天平（Mettler Tledo XSR205DU），瑞士Mettler Tledo公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Reference A+），默克化工；精密干燥箱（FD115型），德國愛安姆公司；可調(diào)移液器，德國 Brand公司；渦旋振蕩器，海太集團(tuán)；20 mL具塞耐熱玻璃試管。

甲醇、三氟乙酸（色譜純），德國Merck公司；濃鹽酸（優(yōu)級純），廣州化學(xué)試劑廠；本試驗(yàn)中用水符合《GB/T 6682—2008分析試驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》[10]中一級水的規(guī)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)原理

試樣經(jīng)鹽酸水解后測定蛋白質(zhì)含量，消解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜儀分析，經(jīng)DAD檢測器（波長280 nm）測定，外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量[6]。

1.2.2 樣品前處理

吸取2.00 mL樣品，置于密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，混勻，密閉試管。然后將其置于干燥箱中，在110 ℃下加熱水解過夜（20～23 h）。加熱約1 h后，輕輕搖動試管。加熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后混勻，用Wateman 1號濾紙干過濾，保留濾液待測。試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測定：吸取2.00 mL試樣水解液，按GB 5009.5—2016[11]的規(guī)定測定試樣水解液中的蛋白質(zhì)含量。試樣水解液中糠氨酸含量的測定：吸取0.50 mL試樣水解液，加入2.50 mL超純水，混勻，過0.22 μm PVDF針式濾膜，濾液進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.2.3 試劑配制

（1）鹽酸溶液（3 mol/L）：在7.5 mL水中加入2.5 mL濃鹽酸，混勻。

（2）鹽酸溶液（10.6 mol/L）：在12 mL水中加入88 mL濃鹽酸，混勻。

（3）流動相A（含0.1 %三氟乙酸的5%甲醇水溶液）：取949 mL純水倒入1 L的容量瓶中，加入50 mL甲醇，加入1 mL三氟乙酸后立即蓋上蓋子，輕搖至三氟乙酸全部溶解沒有霧氣，超聲脫氣15 min。（4）流動相B（含0.085 %三氟乙酸的95%甲醇水溶液）：取950 mL甲醇倒入1 L的容量瓶中，加入49.15 mL純水，加入0.85 mL三氟乙酸后立即蓋上蓋子，輕搖至三氟乙酸全部溶解沒有霧氣，超聲脫氣15 min。

1.2.4 色譜條件

經(jīng)過測試，高效液相色譜儀的色譜條件如下。

色譜柱：Waters HSS T3150 mm×4.6 mm，5.0 μm粒徑；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；流動相A為含0.1 %三氟乙酸的5 %甲醇水溶液、流動相B為含0.085 %三氟乙酸的95 %甲醇水溶液；洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

利用流動相A和流動相B的混合液（50∶50）以1 mL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。然后，用初始流動相平衡系統(tǒng)直至基線穩(wěn)定。注入10 μL 3 mol/L鹽酸溶液，以檢測溶劑的純度。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

1.3.1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制（250 mg/L）：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)準(zhǔn)品證書提供的肽純度系數(shù)（0.69）換算后，用3 mol/L鹽酸溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃下可儲存24 個(gè)月。

1.3.2 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液放至室溫，準(zhǔn)確吸取糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液6 μL、10 μL、20 μL、100 μL、400 μL，用3 mol/L的鹽酸溶液定容至25 mL，配制成濃度為0.06 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L、4.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下可儲存21 天[8]。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作：糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液通過液相色譜儀分析，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 計(jì)算

1.4.1 試樣測定

將待測溶液上機(jī)測定，根據(jù)計(jì)算公式得到樣品中糠氨酸的含量。

1.4.2 計(jì)算公式

（1）試樣中糠氨酸含量按公式①計(jì)算

糠氨酸含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)F計(jì)，數(shù)值以毫克每百克蛋白質(zhì)（mg/100 g蛋白質(zhì)）表示。計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。

式中：F表示試樣中糠氨酸含量，mg/100 g蛋白質(zhì)；At表示測試樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Astd表示糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Cstd表示糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/L；D表示測定時(shí)稀釋倍數(shù)，D=6；m表示樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L。

（2）巴氏殺菌乳殺菌結(jié)束時(shí)糠氨酸的含量按公式②計(jì)算

式中：FT表示巴氏殺菌乳中糠氨酸含量，mg/100g蛋白質(zhì)；F表示試樣中糠氨酸含量，mg/100 g蛋白質(zhì)。

（3）UHT滅菌乳滅菌結(jié)束時(shí)糠氨酸的含量按公式 ③計(jì)算

式中：FT表示滅菌乳中糠氨酸含量，mg/100g蛋白質(zhì)；F表示試樣中糠氨酸含量，mg/100g蛋白；0.7表示常溫下樣品每儲存一天產(chǎn)生的糠氨酸含量，mg/100g蛋白質(zhì)；t表示樣品在常溫下儲存天數(shù)。

2 試驗(yàn)方法的優(yōu)化

本文分別從色譜柱的選擇、流動相的優(yōu)化和酸水解條件等方面對試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.1 色譜柱的選擇

糠氨酸具有較強(qiáng)的極性化學(xué)性質(zhì)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，適合檢測使用的色譜柱有氨基酸專用柱、C18色譜柱和HILIC色譜柱等[12]。本文選擇常見的C18色譜柱進(jìn)行篩選，以期在乳品企業(yè)日常使用過程中不用頻繁更換色譜柱，能同時(shí)滿足牛奶中三聚氰胺、苯甲酸、山梨酸和黃曲霉毒M1等風(fēng)險(xiǎn)項(xiàng)目的檢測使用。由于糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品均經(jīng)過鹽酸處理，pH值較低，此外，流動相中含有少量的三氟乙酸，pH值低至1.71，且洗脫程序中需長時(shí)間走純水流動相，因此需要選擇較耐受純水溶液及低酸度的寬 pH范圍色譜柱。

試驗(yàn)過程中篩選了試驗(yàn)室常用的安捷倫XDB-C18、Waters BEH C18和Waters HSS T3色譜柱，最終選擇了更耐受高比例水相及低pH流動相的HSS T3色譜柱，其對目標(biāo)物的保留效果良好，能有效分離目標(biāo)化合物和干擾物，測試糠氨酸樣品可以達(dá)到700 個(gè)以上，且能適用于試驗(yàn)室多種風(fēng)險(xiǎn)項(xiàng)目的日常檢測，總測試樣品可以達(dá)到1200 個(gè)以上，相對于普通C18反相柱僅可檢測150～300 個(gè)樣品有了明顯改進(jìn)[13，14]。

2.2 流動相的優(yōu)化

牛奶中富含多種氨基酸成分，在使用液相色譜對糠氨酸進(jìn)行檢測的過程中，存在許多其他氨基酸類干擾物等，因此優(yōu)化流動相十分重要。試驗(yàn)過程中比較了酸性體系（0.1 % 三氟乙酸水溶液）和非酸性體系（6 g/L乙酸銨溶液）分別與甲醇、乙腈的流動相體系組合對目標(biāo)化合物的分離情況，最終選擇以三氟乙酸作為離子對試劑，甲醇作為有機(jī)改性劑的流動相體系，經(jīng)過對流動相比例的反復(fù)優(yōu)化，最終確定色譜條件（表1）。在此條件下，色譜基線平穩(wěn)，目標(biāo)物質(zhì)峰型良好（圖1），分離效果良好，且避免了長時(shí)間水相沖洗對色譜柱選成的傷害，延長了色譜使用壽命。

圖1 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(1.0 mg/L)色譜圖

2.3 酸水解方法的確定

目前對糠氨酸的酸水解方法包括傳統(tǒng)加熱水解、蒸汽水解、微波消解等方法[7]。本文采用傳統(tǒng)加熱水解法對樣品進(jìn)行前處理。研究表明，酸水解時(shí)鹽酸濃度對形成糠氨酸的產(chǎn)率有很大影響，且低濃度的鹽酸不能完全阻止水解過程中美拉德反應(yīng)繼續(xù)產(chǎn)生新的糠氨酸[7、11、15]，試驗(yàn)最終選擇使用10.6 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行酸水解試驗(yàn)。

取質(zhì)控樣品按1.2 試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測，其中酸水解時(shí)間分別設(shè)置為12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h，檢測結(jié)果如表2所示。

表2 酸水解時(shí)間對糠氨酸含量的影響

從表2可以看出，酸水解時(shí)間達(dá)20 h后，質(zhì)控樣品糠氨酸含量趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)過程中可以根據(jù)具體時(shí)間安排進(jìn)行酸水解處理，采用110 ℃加熱水解20 ～23 h。尉鑫欣[14]對酸水解時(shí)間對糠氨酸形成的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糠氨酸濃度在700～1100 μg/L時(shí)，水解16 h后糠氨酸含量基本無顯著變化；陳沖沖[16]在對酸水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糠氨酸濃度在122.1 mg/100g蛋白質(zhì)時(shí)，水解12 h后糠氨酸含量基本無顯著變化，這可能是由于樣品中糠氨酸的含量不同造成的。在乳品企業(yè)糠氨酸的日常監(jiān)測過程中，由于熱處理強(qiáng)度不同，純牛奶中糠氨酸含量可能達(dá)到200 mg/100g蛋白質(zhì)以上，需要適當(dāng)延長酸水解時(shí)間以確保反應(yīng)完全。

3 結(jié)果與分析

根據(jù)《GB/T 27417—2017合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[17]，本文從線性范圍、檢出限和定量限、精密度和正確度等方面來確認(rèn)方法的可行性。

3.1 線性范圍

在試驗(yàn)選定的色譜條件下，將1.3.2中所配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液依次上機(jī)測定，每個(gè)濃度重復(fù)測定6 次，得到標(biāo)準(zhǔn)工作液每個(gè)濃度點(diǎn)的色譜平均峰面積及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)測定結(jié)果如表3，標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖如圖1。

表3 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)測定結(jié)果

從表3可知，標(biāo)準(zhǔn)工作液每個(gè)濃度點(diǎn)上機(jī)檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.13%～1.46%之間，重復(fù)性良好。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。制得的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍（0.06～4.00 mg/L），回歸方程（y=37.996360 4x+0.441324 7），相關(guān)系數(shù)（R2＝0.9997），線性關(guān)系良好，可用于實(shí)際分析檢測。

圖2 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3.2 檢出限和定量限

根據(jù)測定結(jié)果，取3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限，取10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限，得到方法的檢出限為0.02 mg/L，定量限為0.065 mg/L。將該濃度代入1.4.2（1）公式①計(jì)算，m值取牛奶中蛋白質(zhì)水解液的平均濃度0.8 g/L，得到方法的檢出限為1.5 mg/100g蛋白質(zhì)，定量限為4.9 mg/100g蛋白質(zhì)[18，19]。許多報(bào)道顯示，生乳、巴氏殺菌乳和滅菌乳中的糠氨酸的含量為3.00～5.73 mg/100g蛋白質(zhì)、2.86～68.8 mg/100g蛋白質(zhì)和35～300 mg/100g蛋白質(zhì)[16，20～24]，方法的檢出限和檢測范圍基本可以滿足企業(yè)日常監(jiān)測需求。

3.3 精密度和回收率試驗(yàn)

選用本底較低的巴氏殺菌乳作為加標(biāo)回收底物，分別吸取一定量的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成加標(biāo)濃度5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、30 mg/L的加標(biāo)樣品，充分混勻后按1.2的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品平行測定6 次，取平均值計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表4，巴氏殺菌乳中糠氨酸色譜圖見圖3。

表4 糠氨酸加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

圖3 巴氏殺菌乳中糠氨酸色譜圖

從表4可知，在5～30 mg/L的加標(biāo)濃度下，巴氏殺菌乳中糠氨酸的平均加標(biāo)回收率在91.48%～91.73%之間，RSD在0.13%～0.37%之間，方法的加標(biāo)回收率穩(wěn)定，正確度高，重復(fù)性良好，可作為實(shí)際樣品的準(zhǔn)確定量檢測方法。

3.4 樣品的檢測

取3 個(gè)不同熱處理強(qiáng)度的牛奶樣品，按1.2 試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品平行測定6 次，并與第三方檢測機(jī)構(gòu)（北京畜牧研究所）的結(jié)果對比，檢測結(jié)果見表5。

從表5可以看出，無論是低濃度樣品還是高濃度樣品，本方法檢測結(jié)果與第三方機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果偏差均＜1.00%。

表5 糠氨酸檢測結(jié)果比對

4 討論和結(jié)論

目前測定牛奶中糠氨酸含量的方法很多。盧沛明等[25]建立高效液相色譜法檢測乳制品中的糠氨酸含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R2=1.000），方法檢出限0.5 mg/kg，加標(biāo)回收率81.0%～87.2%，RSD值小于3.5 %；張文青等[24]建立高效液相色譜法檢測巴氏殺菌乳中的糠氨酸含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R2=0.9990），方法檢出限2.8 mg/100g蛋白質(zhì)，加標(biāo)回收率84.62%～101.4%，RSD值≤1.0%；馮婉瑩等[15]建立UPLC-Q-TOF/MS法測定液態(tài)乳中的糠氨酸，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R2=0.9997），方法檢出限為250 ug/kg，加標(biāo)回收率84.0%～86.2%，RSD值1.08 %～4.01%；黃文強(qiáng)等[13]建立液相色譜法測定乳制品中的糠氨酸，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（R2=0.9990），加標(biāo)回收率90.6 %～93.8 %，RSD值為0.73%。本文改良高效液相色譜法檢測牛奶中糠氨酸的含量，方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好（R2=0.9997），方法檢出限1.5 mg/100g蛋白質(zhì)，定量限為4.9 mg/100g蛋白質(zhì)，平均加標(biāo)回收率在91.48%～91.73%之間，RSD在0.13%～0.37%之間，測得結(jié)果與第三方機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果偏差小于1.00%，比上述方法具有優(yōu)勢，不但靈敏度更高，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、重現(xiàn)性更好，回收率更高，操作過程更簡便，且色譜柱適用范圍廣、使用壽命長，適用于乳品企業(yè)對糠氨酸的日常監(jiān)測。