買爾哈巴·艾合買提，曹 英，2，崔衛(wèi)東，陳鋼糧，侯新強(qiáng)，薛 杉，2，侯 敏

1 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 8300912 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 8300523 新疆旺源生物科技集團(tuán)有限公司，新疆福海 836400

0 引言

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用，因胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足及細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低等一系列代謝紊亂的臨床綜合征[1]。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布的最新數(shù)據(jù)，2021年全球約5.37 億成年人患有糖尿病，我國(guó)是全球糖尿病第一大國(guó)，患者數(shù)高達(dá)1.298 億人，其中Ⅱ型糖尿病占比超過90%。目前Ⅱ型糖尿病的主要治療方法是口服降糖藥物、合理飲食控制體重、達(dá)到降低血糖的目的[2]。但多項(xiàng)研究顯示，長(zhǎng)期使用降糖藥物會(huì)產(chǎn)生惡心、胃腸道不適等不良反應(yīng)[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此研發(fā)副作用小、兼顧治療并發(fā)癥的藥物，特別是天然物質(zhì)的開發(fā)利用，在治療糖尿病方面成為一種新的流行趨勢(shì)[4]。

發(fā)酵駝乳是以新鮮駝乳為原料，經(jīng)殺菌、接種發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品[5]。經(jīng)微生物發(fā)酵后的駝乳，大分子物質(zhì)被降解，產(chǎn)生游離氨基酸、多肽、游離脂肪等，有利于機(jī)體消化吸收，乳糖被分解轉(zhuǎn)化為乳酸、乙醇并生成醛、酮、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，賦予發(fā)酵乳特有的風(fēng)味和口感[6]。此外，駝乳在微生物的作用下也能產(chǎn)生一系列具有增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、降糖降脂的功能性物質(zhì)[7]。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)益生菌能顯著改善糖尿病大鼠的胰島抵抗，益生菌通過上調(diào)G蛋白偶聯(lián)受體43/41，觸發(fā)胰高血糖素樣肽-1分泌增強(qiáng)胰島素分泌，改善腸道屏障功能，降低大鼠的血糖水平。糖尿病長(zhǎng)期發(fā)展會(huì)產(chǎn)生多種并發(fā)癥，造成多種器官、系統(tǒng)的損傷，而肝臟組織的受損會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[9]。有研究報(bào)道，發(fā)酵駝乳能極顯著提高小鼠血清、腦組織和骨骼肌中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化活力，降低小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。目前對(duì)于發(fā)酵駝乳的研究多集中于發(fā)酵駝乳中微生物的多樣性、免疫活性肽的分離鑒定等，較少有對(duì)發(fā)酵駝乳體外降糖活性指標(biāo)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定及與抗氧化活性相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

因此本研究將實(shí)驗(yàn)室前期從駝乳中分離純化得到的副干酪乳桿菌和乳明串珠菌混合發(fā)酵駝乳，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵駝乳的最優(yōu)工藝參數(shù)，得到發(fā)酵乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最大抑制率，通過測(cè)定發(fā)酵駝乳和牛乳在儲(chǔ)藏期間的一系列指標(biāo)，比較不同發(fā)酵乳的發(fā)酵性能和體外降糖活性，為將駝乳開發(fā)成具有輔助降血糖作用的發(fā)酵乳制品提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)與方法

1.1 材料與試劑

乳明串珠菌、副干酪乳桿菌，前期實(shí)驗(yàn)室分離純化所得；新鮮駝乳，阿勒泰吉木乃萬駝園養(yǎng)駝戶提供；西域春滅菌牛乳；MRS肉湯培養(yǎng)基、α-淀粉酶、可溶性淀粉、DNS試劑、α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷、磷酸緩沖液，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)（METTLER TOLEDO型）、高速冷凍離心機(jī)（Presoo17型）、恒溫培養(yǎng)箱（ZWY型），上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD型），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型），上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-6550型），日本自動(dòng)化設(shè)備公司；酶標(biāo)儀（SepectraMaxM5e型），MOLECULAR DEVICES，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

將乳酸菌發(fā)酵液按3%接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化傳代，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～18 h，活化培養(yǎng)三代。新鮮駝乳經(jīng)過4000 r/min，15 min離心后棄去脂肪層，95 ℃滅菌5 min，將滅菌駝乳冷卻至42 ℃左右，在超凈工作臺(tái)中接入3%的發(fā)酵液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后置于4 ℃冰箱中冷藏。

1.3.2 接種比例工藝優(yōu)化

將乳明串珠菌和副干酪乳桿菌分別以1∶2、2∶3、1∶1、3∶2和2∶1的比例，按照2%的接種量將發(fā)酵劑接種到滅菌的脫脂駝奶中，置于37 ℃下發(fā)酵24 h。測(cè)定發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選擇合適的接種比例。

1.3.3 接種量工藝優(yōu)化

在接種比例1∶1、發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，接種量分別按照1%、2%、3%、4%和5%，待發(fā)酵24 h后測(cè)定發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選擇合適的接種量。

1.3.4 發(fā)酵溫度工藝優(yōu)化

在接種比例1∶1、接種量2%的條件下，將發(fā)酵溫度設(shè)置為35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃，待發(fā)酵24 h后測(cè)定發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，選擇合適的發(fā)酵溫度。

1.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種比例（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）為正交試驗(yàn)的3 個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定發(fā)酵駝乳的最優(yōu)工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表L9（34）

1.5 發(fā)酵乳指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)正交試驗(yàn)所得最優(yōu)參數(shù)制備發(fā)酵駝乳作為試驗(yàn)組，同一條件下發(fā)酵牛乳作為CK1，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵駝乳作為CK2，3 份樣品發(fā)酵24 h后，取出后置于4 ℃下儲(chǔ)藏，并在不同儲(chǔ)藏時(shí)間（0 d、3 d、6 d、9 d、12 d）進(jìn)行采樣，測(cè)定以下指標(biāo)。

1.5.1 發(fā)酵乳pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)測(cè)定3 次取平均值

1.5.2 發(fā)酵乳滴定酸度的測(cè)定

滴定酸度用吉爾涅爾度（oT）表示，參考《GB 5009.239—2016 乳和乳制品酸度的測(cè)定》。用吸管量取10 mL的樣品進(jìn)入三角瓶?jī)?nèi)，用20 mL的蒸餾水稀釋，加入0.5 mL 0.5%的酚酞溶液，將混合物小心地?fù)u動(dòng)均勻，用0.1 mol/L NaoH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，邊滴加邊轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，滴定至微紅色，在2 min內(nèi)不消失即達(dá)到滴定終點(diǎn)。

酸度（oT）=A×10

式中：A——到滴定終點(diǎn)時(shí)消耗0.1 mol/L NaoH溶液的用量（mL）

1.5.3 發(fā)酵乳活菌數(shù)的測(cè)定

稱取25 mL發(fā)酵乳置于225 mL滅菌蒸餾水中，充分搖勻后形成稀釋液，梯度稀釋合適的倍數(shù)，取100 μL的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況記錄菌落數(shù)，每個(gè)梯度重復(fù)3 次取平均值。

1.5.4 對(duì)α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

將制備的發(fā)酵乳取50 mL，在轉(zhuǎn)速為10000 r/min溫度為4 ℃的條件下離心30 min，取上清液于4 ℃冰箱中備用，用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定用。

125 μL樣品溶液與1 mg /mL的α-淀粉酶溶液等體積混合，于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，然后將反應(yīng)液加入至37 ℃的250 μL的1.5%的可溶性淀粉溶液中，于37 ℃反應(yīng)15 min，再加入500 μL DNS溶液，沸水浴中反應(yīng)5 min后迅速冷卻至室溫，稀釋20 倍后靜置30 min，并于540 nm 處測(cè)定吸光值。用PBS溶液（0.1 mol /L，pH = 6.8）作為α-淀粉酶溶液和待測(cè)樣品的空白對(duì)照。

式中：A為樣品組，含有樣品溶液和α-淀粉酶溶液；B為樣品空白組，含有樣品溶液、不含α-淀粉酶溶液；C為對(duì)照組，不含樣品溶液、含α-淀粉酶溶液；D為空白組，不含樣品溶液、不含α-淀粉酶溶液。

1.5.5 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

在50 μL的樣液中加入100 μL濃度為0.125 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，將混合物于37 ℃孵化10 min，繼續(xù)加入50 μL 濃度為5 mmol/L的PNPG溶液，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，最后加入50 μL濃度為0.2 mol/L Na2CO3作為反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，將全部反應(yīng)液于405 nm處測(cè)定吸光度值。用PBS 溶液（0.1 mol /L，pH = 6.8）作為α-葡萄糖苷酶溶液和待測(cè)樣品的空白對(duì)照。

式中：A為樣品組，含有樣品溶液和α-葡萄糖苷酶溶液；B為樣品空白組，含有樣品溶液、不含α-葡萄糖苷酶溶液；C為對(duì)照組，不含樣品溶液、含α-葡萄糖苷酶溶液；D為空白組，不含樣品溶液、不含α-葡萄糖苷酶溶液。

1.5.6 羥自由基清除能力的測(cè)定

羥自由基是活性氧自由基的一種，體內(nèi)自由基的積累會(huì)破壞細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)、造成細(xì)胞功能喪失、基因突變引發(fā)人體高血壓、癌癥等一系列疾病[11]，因此清除過量自由基，可有效提高機(jī)體的免疫功能，加快機(jī)體新陳代謝。H2O2和Fe2+通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，水楊酸與產(chǎn)生的羥自由基反應(yīng)生成有色物質(zhì)2，3-二羥基苯甲酸，在510 nm處有最大吸收峰，加入具有清除能力的物質(zhì)后，有色物質(zhì)便會(huì)減少，從而根據(jù)吸光值的數(shù)值判斷樣品清除羥自由基的能力。

1.5.7 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

AP-TEMED系統(tǒng)[12]產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-，NO2-與對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在530 nm處有特征峰，樣品對(duì)超氧陰離子的清除能力與530 nm的吸光值呈負(fù)相關(guān)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 22、Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析，Origin2021軟件繪制作圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 接種比例對(duì)發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1為接種比例對(duì)發(fā)酵乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，由圖可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃，接種量為2%，接種比例為1∶1、1∶2、2∶3、2∶1、3∶2時(shí)，隨著接種比例的變化，發(fā)酵乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)接種比例為2∶3時(shí)抑制活性最高，因此選擇1∶1、1∶2、2∶3作為后續(xù)正交優(yōu)化條件。

圖1 接種比例對(duì)發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.1.2 接種量對(duì)發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖2為發(fā)酵劑接種量對(duì)發(fā)酵乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，由圖可以看出，當(dāng)發(fā)酵劑的接種比為2∶3、發(fā)酵溫度為37 ℃、接種量為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)，隨著接種量的增大，發(fā)酵乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵劑的接種量為3%時(shí)，發(fā)酵乳對(duì)兩種酶的抑制活性最高，因此選擇2%、3%、4%作為后續(xù)正交優(yōu)化條件。

圖2 接種量對(duì)發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖3 為發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵乳α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，由圖可以看出，當(dāng)接種比例為2∶3、接種量為2%、發(fā)酵溫度為35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時(shí)，發(fā)酵乳對(duì)兩種酶的抑制活性最高，因此選擇37 ℃、39 ℃、41 ℃作為正交優(yōu)化條件。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵乳抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種比例（A）、發(fā)酵劑接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）3 個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素結(jié)果表

分別以α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，由極差分析得到各因素對(duì)兩種酶抑制率影響的主次順序?yàn)镃＞B＞A，即發(fā)酵溫度對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響最大，其次是接種量，接種比例的影響最小。發(fā)酵乳中通過微生物的代謝作用產(chǎn)生各種活性因子達(dá)到抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的作用，適宜的溫度有利于促進(jìn)微生物新陳代謝，因此發(fā)酵溫度對(duì)抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性影響較大。通過正交試驗(yàn)結(jié)果可知，最優(yōu)水平組合為A3B1C2，即接種比例2∶3、接種量2%、發(fā)酵溫度39 ℃，按照最佳參數(shù)得到的發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別達(dá)到87.20%和23.85%，與未優(yōu)化前相比，α-淀粉酶的抑制率提高14.10%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高4.4%。

2.3 發(fā)酵乳指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵乳pH值的變化

由圖4可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，三組發(fā)酵乳的pH值呈下降趨勢(shì)，且發(fā)酵駝乳的pH值顯著低于發(fā)酵牛乳，試驗(yàn)組的pH由第0d的4.90下降到第12 d的4.20，下降了14.28%；CK1組pH值由起始的4.92下降到4.30，下降12.60%；CK2的pH值從發(fā)酵起始的4.91下降到第12 d時(shí)的4.22，下降了14.05%。三組發(fā)酵乳前期pH值降低較為緩慢，其原因可能是乳酸菌活菌數(shù)較少，活力相對(duì)較弱，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加乳酸菌利用乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷分解乳糖產(chǎn)生乳酸，生長(zhǎng)活力旺盛，開始大量繁殖，降低發(fā)酵乳的pH值。

圖4 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳的pH值變化

2.3.2 發(fā)酵乳滴定酸度的變化

滴定酸度是發(fā)酵乳發(fā)酵過程中重要的理化指標(biāo)之一，從圖4和圖5可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，三種發(fā)酵乳的滴定酸度均逐漸升高，與pH值變化趨勢(shì)相反。試驗(yàn)組、CK1、CK2的起始發(fā)酵酸度分別為81oT、89oT、83oT，符合發(fā)酵乳的國(guó)標(biāo)規(guī)定數(shù)值≥70oT，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物數(shù)量逐漸增多，發(fā)酵酸度也逐漸增大。到發(fā)酵第12d時(shí)，試驗(yàn)組和CK2發(fā)酵駝乳的酸度分別達(dá)到128oT和127oT，CK1發(fā)酵牛乳組的酸度為109oT。到儲(chǔ)藏第12 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組、CK1和CK2的酸度值同第0 d時(shí)分別增加了33.59%、25.68%、34.64%。酸度和pH值呈負(fù)相關(guān)，酸度值越大pH值越低，在冷藏期間乳酸菌不斷分解乳糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳的酸度不斷降低。

圖5 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳的酸度變化

2.3.3 發(fā)酵乳活菌數(shù)變化

由圖6可以看出，三組發(fā)酵乳的活菌數(shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵起始試驗(yàn)組的活菌數(shù)為8.8×107CFU/mL，CK1和CK2的活菌數(shù)分別為1.23×108CFU/mL和8.2×107CFU/mL，均高于發(fā)酵駝乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的1×106CFU/mL。從圖6中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，三組發(fā)酵乳的活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，試驗(yàn)組和CK2在第3 d時(shí)，活菌數(shù)最高分別達(dá)到2.71×108CFU/mL和1.41×108CFU/mL，到發(fā)酵第12 d，兩組發(fā)酵乳活菌數(shù)逐漸降低為9.8×107CFU/mL和7.6×107CFU/mL，但試驗(yàn)組活菌數(shù)仍然高于發(fā)酵起始活菌數(shù)。CK1發(fā)酵乳最高活菌數(shù)在第9d時(shí)達(dá)到最大3.82×108CFU/mL，隨后降低為1.94×108CFU/mL，到發(fā)酵后期隨著發(fā)酵乳的酸度升高，過酸的環(huán)境不適合乳酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵乳的活菌數(shù)開始下降。

圖6 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳的活菌數(shù)變化

2.3.4 對(duì)α-淀粉酶抑制率的變化

從圖7可以看出三組發(fā)酵乳對(duì)α-淀粉酶的抑制率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，試驗(yàn)組對(duì)α-淀粉酶抑制率從87.20%降低到78.37%，在第6d時(shí)，試驗(yàn)組對(duì)α-淀粉酶抑制率達(dá)到最大90.39%，且試驗(yàn)組對(duì)α-淀粉酶抑制率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在第3d時(shí)，CK1對(duì)α-淀粉酶抑制率最大為68.28%，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸降低為20.84%，CK2對(duì)α-淀粉酶抑制率的最大值為75.72%，在第12 d時(shí)降低為18.71%。試驗(yàn)組總體都保持較高的α-淀粉酶抑制率，是由于駝乳本身就含有降糖活性因子，經(jīng)過益生菌的發(fā)酵產(chǎn)生更多的降糖活性肽等。

圖7 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳對(duì)α-淀粉酶抑制率的變化

2.3.5 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的變化

從圖8中可以看出，試驗(yàn)組對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率逐漸升高，而對(duì)照組對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，試驗(yàn)組對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著均高于對(duì)組（P＜0.05）。整個(gè)儲(chǔ)藏期間試驗(yàn)組對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率從20.85%升高至36.32%，提升了42.49%，CK1對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率在第6 d時(shí)達(dá)到最高為24.45%，CK2對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率在第9 d時(shí)達(dá)到最高30.97%。儲(chǔ)藏后期抑制率降低可能與發(fā)酵后期活菌數(shù)數(shù)量下降有關(guān)，由于發(fā)酵乳pH值降低，產(chǎn)生過多的乳酸影響菌體的生長(zhǎng)，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成受到影響，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率降低。

圖8 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的變化

2.3.6 對(duì)羥自由基清除率的變化

三組發(fā)酵乳對(duì)羥自由基清除率的變化，由圖9可以看出，試驗(yàn)組和CK2組對(duì)羥自由基的清除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，試驗(yàn)組對(duì)羥自由基清除率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。CK1對(duì)羥自由基的清除率隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，但始終低于試驗(yàn)組對(duì)羥自由基的清除率。在第9d時(shí)，試驗(yàn)組對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到最大值94.41%，與第0d相比增加了16.2%，到發(fā)酵第12d，試驗(yàn)組對(duì)羥自由基的清除率為87.61%，仍然保持較高的清除率。CK1對(duì)羥自由基的清除率從60.74%增加到73.23%，CK2對(duì)羥自由基的清除率最高為86.55%，在第12d降低為66.29%。

圖9 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳對(duì)羥自由基清除率的變化

2.3.7 對(duì)超氧陰離子清除率的變化

發(fā)酵乳對(duì)超氧陰離子清除率的變化如圖10所示，從圖中可以看出，試驗(yàn)組和CK2對(duì)超氧陰離子的清除率隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，試驗(yàn)組從第0d的65.56%的清除率升高至第1 d的77.47%，增加了15.4%。CK1對(duì)超氧陰離子的清除率先升高后降低，最高清除率為68.88%，在第12d時(shí)，降低60.09%。CK2對(duì)超氧陰離子的清除率從54.01%升高到71.13%。試驗(yàn)組在整個(gè)儲(chǔ)藏時(shí)期內(nèi)對(duì)超氧陰離子自由基的清除率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖10 不同儲(chǔ)藏時(shí)間發(fā)酵乳對(duì)超氧陰離子自由基清除率的變化

3 討論與結(jié)論

隨著人們對(duì)乳酸菌益生功能的深入認(rèn)識(shí)，越來越多乳酸菌被用于發(fā)酵乳制品、飲料、保健食品等，發(fā)酵乳制品作為益生菌的載體，能充分發(fā)揮乳酸菌的益生作用[13]。通過添加功能性成分制作發(fā)酵乳制品，如富含寡糖的乳制品有助于維持血脂健康，乳中添加維生素D、膠原蛋白肽、牛初乳堿性蛋白等開發(fā)減緩中老年人骨質(zhì)流失及骨質(zhì)疏松癥的功能性乳制品[14]。因此在發(fā)酵乳中添加具有降血糖功能的功能物質(zhì)，不僅增加發(fā)酵乳制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也為糖尿病患者提供一種新型、有輔助治療疾病的乳制品。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率被認(rèn)為是研究體外降糖活性的間接指標(biāo)，兩種酶抑制劑通過延緩體內(nèi)碳水化合物的消化吸收，降低餐后血糖水平的升高，因此抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性在防治糖尿病方面有巨大潛力[15]。發(fā)酵駝乳中益生菌通過分泌蛋白水解酶水解駝乳中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的生物活性肽、活性因子等，對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有普遍抑制作用[16]。Ayyash[17]等比較了發(fā)酵駝乳和牛乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率均高于發(fā)酵牛乳與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致，學(xué)者們認(rèn)為有兩種原因：一是發(fā)酵使用的益生菌本身分離自駝奶，因此對(duì)駝奶有更高的適應(yīng)性；二是駝奶中富含的胰島素、降糖活性因子等高于牛乳，因此發(fā)酵駝乳與牛乳相比表現(xiàn)出較高的抑制率和抗氧化活性[18]。

抗氧化活性是發(fā)酵乳制品重要的營(yíng)養(yǎng)特性，乳制品經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用生成各種生物活性肽，對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性產(chǎn)生積極影響[19]。Hamed等[20]研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌發(fā)酵駝乳可通過清除體內(nèi)自由基和抑制活性氧的積累來防止體內(nèi)的氧化損傷，提高機(jī)體的抗氧化活性。Patel等[21]用植物乳桿菌發(fā)酵駝乳測(cè)定發(fā)酵乳的抗氧化活性，在37 ℃發(fā)酵48 h后，發(fā)酵乳對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基清除率分別達(dá)到61.52%和52.26%。EI-Sayed等[22]以不同的乳酸菌發(fā)酵駝乳，測(cè)定發(fā)酵駝乳在儲(chǔ)藏期間的抗氧化活性，研究發(fā)現(xiàn)與市售的商業(yè)發(fā)酵劑相比益生菌發(fā)酵駝乳具有更高的抗氧化活性，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致，試驗(yàn)組的自由基清除率顯著高于對(duì)照組，他們認(rèn)為發(fā)酵菌株的來源、數(shù)量、蛋白質(zhì)的水解活性等因素都會(huì)影響發(fā)酵乳的抗氧化活性。

本試驗(yàn)通過乳明串珠菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵駝乳以α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵駝乳的參數(shù)條件，通過正交試驗(yàn)得到發(fā)酵駝乳的最佳工藝參數(shù)為乳明串珠菌:副干酪乳桿菌比例2∶3、接種量2%、發(fā)酵溫度39 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h，在此條件下測(cè)得發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別達(dá)到87.20%和23.85 %，與未優(yōu)化前相比，α-淀粉酶的抑制率提高14.10%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高4.4%。在4 ℃儲(chǔ)藏期間發(fā)酵駝乳對(duì)α-淀粉酶抑制率在第6d時(shí)最高為90.39%，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為36.32%，抑制率顯著高于對(duì)照組。對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基清除率最高達(dá)到94.91 %和78.10%，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。