張 春，駱 強(qiáng)，馮 圖

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700）

苔蘚植物(Bryophytes)喜歡陰暗潮濕的環(huán)境，通常生長(zhǎng)在裸露的石壁、潮濕的森林和沼澤等地。[1]苔蘚植物即使在含有大量微生物的土壤或腐殖質(zhì)上生長(zhǎng)，也不容易被細(xì)菌或真菌感染[2]。研究表明，苔蘚植物通過(guò)次生代謝可以產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、黃酮類、脂肪酸以及一些生物活性物質(zhì)，是潛在的天然活性產(chǎn)物寶庫(kù)[3]。目前，已有多種苔蘚植物被證明具有抑制微生物活性的作用[4]，博雷克（Borelc）等研究了地衣的抑菌物質(zhì)[5]。巴茲爾（Basilea）等從4種苔蘚植物中提取出牡荊葡基黃酮和黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物對(duì)8種細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌性[6]。范·霍夫（Van Hoof）研究了20種苔蘚植物提取液抗細(xì)菌和抗真菌活性[7]。沙偉等利用濾紙片法對(duì)9種苔蘚植物抑菌能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)9種苔蘚植物中多數(shù)種類對(duì)目的菌株具有一定的抑制作用[8]。沙偉還對(duì)16種苔蘚植物對(duì)植物病原菌的抑菌性進(jìn)行了研究[9]，表明多數(shù)苔蘚植物提取物對(duì)4種植物病原菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用。程輝彩[10]等研究了24種蘚類的乙醇提取物對(duì)病原真菌的抑制作用，陳錫雄[11]等對(duì)尖葉提燈蘚的抑菌性進(jìn)行了初步研究，吳昆對(duì)貴州省4種蘚類植物抑菌性做了比較[12]。全世界苔蘚植物約23000種，現(xiàn)已研究了抑菌性的苔蘚植物種類還非常少，對(duì)苔蘚植物抑菌性的研究還有很大的空間。

本研究通過(guò)對(duì)8種苔蘚植物的抑菌性實(shí)驗(yàn)，探究苔蘚植物不同種之間抑菌性的差異，從而為苔蘚植物的種間差異、資源保護(hù)和篩選藥用苔蘚植物及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

11種供試細(xì)菌為：表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、銅綠假單孢菌（Pseudomonas aerugi-nosa）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi-B），均來(lái)源于上海魯微科技公司。

供試材料為8種苔蘚植物，詳見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本名稱及采集地點(diǎn)

1.2 研究方法

1.2.1 供試樣品處理

苔蘚植物提取液制備：從野外采集全株苔蘚植物樣品，反復(fù)用自來(lái)水沖洗，然后用去離子水清洗3次，放入烘箱中，50℃恒溫條件下烘干24小時(shí)，用電動(dòng)粉碎機(jī)將苔蘚植物體粉碎。取樣品粉末2.0g，置于具橡膠塞的三角瓶中，加無(wú)水乙醇20ml，搖床上振蕩提取20h，以1500 r/min離心10min，收集上清液，將殘?jiān)儆脽o(wú)水乙醇重復(fù)提取2次，方法同上。合并3次的提取液于小燒杯中，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基類型配置液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基的配置：蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，將稱好的藥品置于燒杯中，加入少量蒸餾水，用玻璃棒攪拌，加熱溶解，待全部藥品溶解后，加水至所需體積1000mL，利用0.5mol/L NaOH將pH調(diào)制7.2～7.4，之后過(guò)濾、分裝、滅菌，最后將配置好的培養(yǎng)基放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。固體培養(yǎng)基的配置是蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂粉15g，除無(wú)需過(guò)濾外，其余步驟同液體培養(yǎng)基制備。

1.2.3 菌懸液的制備

取供試細(xì)菌菌株，用接種環(huán)各取菌苔少許接種至牛肉膏、蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h活化，然后將活化后的菌株接一環(huán)于5mL液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器中37℃下培養(yǎng)6～8h，即制成菌懸液。

1.2.4 濾紙片法測(cè)定抑菌作用

取直徑12mm的滅菌濾紙片放入上述苔蘚植物提取液中浸泡過(guò)夜，將菌懸液各取0.5 mL與相應(yīng)的固體培養(yǎng)基制成含菌平板，用無(wú)菌鑷子取含浸出液的濾紙片貼在含菌平板上，每皿貼4片，每菌做3次重復(fù)，且用無(wú)水乙醇浸泡濾紙片作空白對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺以十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑[13]。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

由于8種苔蘚植物抑菌活性物質(zhì)均用無(wú)水乙醇提取，無(wú)水乙醇的抑菌直徑均值為對(duì)照組。采用系統(tǒng)聚類法首先將各樣本看成一類，有抑菌性記為1，無(wú)抑菌性記為0，使用IBM SPSS Statistics 23分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，利用歐式距離計(jì)算樣品間距離，用最短距離法計(jì)算類群間距離，按系統(tǒng)聚類分析方法對(duì)其進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單種苔蘚植物醇提液抑菌性分析

首先比較苔蘚植物抑菌圈直徑與對(duì)照組無(wú)水乙醇抑菌圈直徑，大于無(wú)水乙醇抑菌圈直徑的為有抑菌性，小于等于無(wú)水乙醇抑菌圈直徑的視為無(wú)抑菌性，有抑菌性的苔蘚植物，其抑菌圈直徑再與對(duì)照組無(wú)水乙醇抑菌圈直徑做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 8種苔蘚植物提取液對(duì)11種細(xì)菌抑菌圈直徑/mm

從表2可見(jiàn)，金發(fā)蘚、泥炭蘚、粗葉青毛蘚、節(jié)莖曲柄蘚和檜葉白發(fā)蘚醇提液有較強(qiáng)的抑菌廣泛性，金發(fā)蘚醇提液能有效抑制除枯草芽孢桿菌外的10種供試細(xì)菌，且對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性與對(duì)照組相比有極顯著差異，對(duì)銅綠假單孢菌、化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌的抑菌性與對(duì)照組相比有顯著差異。泥炭蘚醇提液能有效抑制除副溶血性弧菌和白色葡萄球菌外的9種供試細(xì)菌，其中對(duì)銅綠假單孢菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌性與對(duì)照組相比有極顯著差異，對(duì)金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌的抑菌性與對(duì)照組相比有顯著差異。粗葉青毛蘚醇提液能有效抑制除銅綠假單孢菌和大腸桿菌外的9種供試細(xì)菌，其中對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌性與對(duì)照組相比有極顯著差異，對(duì)化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌的抑菌性與對(duì)照組相比有顯著差異。節(jié)莖曲柄蘚醇提液和檜葉白發(fā)蘚醇提液對(duì)副溶血性弧菌、白色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌無(wú)抑菌性，對(duì)其余8種供試細(xì)菌均有抑菌性。其中節(jié)莖曲柄蘚對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌抑菌作用與對(duì)照組相比有極顯著差異，對(duì)銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性與對(duì)照組相比有顯著差異，檜葉白發(fā)蘚對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌抑菌作用與對(duì)照組相比有顯著差異。

克什米爾曲尾蘚醇提液、尖葉扭口蘚醇提液和卵葉泥炭蘚醇提液分別對(duì)6種供試細(xì)菌有抑菌作用，克什米爾曲尾蘚醇提液對(duì)銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌有抑菌作用，其中對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌性與對(duì)照組相比有極顯著差異，對(duì)化膿性鏈球菌的抑菌性與對(duì)照組相比有顯著差異。尖葉扭口蘚對(duì)表皮葡萄球菌、銅綠假單孢菌、肺炎克雷伯氏菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌具有抑菌作用，且對(duì)銅綠假單孢菌和乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌作用與對(duì)照組相比有顯著差異。卵葉泥炭蘚醇提液對(duì)表皮葡萄球菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌有抑菌作用，且對(duì)化膿性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌抑菌作用與對(duì)照組相比有極顯著差異，對(duì)傷寒沙門氏菌的抑菌作用與對(duì)照組相比有顯著差異。

2.2 單種細(xì)菌中不同苔蘚植物抑菌性分析

對(duì)8種苔蘚植物醇提液的抑菌性效果進(jìn)行了獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。在銅綠假單孢菌、傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌三種細(xì)菌中，苔蘚植物的抑菌作用表現(xiàn)出差異性，銅綠假單孢菌中泥炭蘚醇提液與克什米爾曲尾蘚醇提液、檜葉白發(fā)蘚醇提液、卵葉泥炭蘚醇提液的抑菌作用相比有顯著差異。傷寒沙門氏菌中泥炭蘚醇提液與檜葉白發(fā)蘚醇提液的抑菌作用相比有極顯著差異。乙型副傷寒沙門氏菌中克什米爾曲尾蘚醇提液、泥炭蘚醇提液、卵葉泥炭蘚醇提液與節(jié)莖曲柄蘚醇提液、檜葉白發(fā)蘚醇提液、尖葉扭口蘚醇提液抑菌作用相比有顯著差異。其余菌種中8種苔蘚植物醇提液抑菌性比較無(wú)差異。門氏菌抑菌性O(shè)：泥炭蘚醇提液對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌抑菌性P：檜葉白發(fā)蘚醇提液對(duì)表皮葡萄球菌抑菌性

圖1 部分苔蘚植物抑菌活性照片

2.3 聚類分析

從聚類圖可見(jiàn)，T=2時(shí)，節(jié)莖曲柄蘚和檜葉白發(fā)蘚聚為一類，說(shuō)明兩種苔蘚醇提液抑菌性具有極大的相似性。T=11時(shí)，克什米爾曲尾蘚和卵葉泥炭蘚聚為一類，T=13時(shí)，節(jié)莖曲柄蘚、檜葉白發(fā)蘚、金發(fā)蘚和泥炭蘚聚為一類，兩大類在T=16時(shí)聚為一類。尖葉扭口蘚和粗葉青毛蘚分別在T=23和T=25時(shí)與其他苔蘚聚為一類，說(shuō)明在兩種苔蘚醇提液的抑菌性與其他6種苔蘚植物醇提液抑菌性有明顯差異。

圖2 8種苔蘚植物抑菌作用聚類圖

3 討論和結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8種苔蘚植物均有廣泛的抑菌作用。通過(guò)對(duì)抑菌作用的比較發(fā)現(xiàn)，已明確有藥用功效的泥炭蘚醇提液和金發(fā)蘚醇提液對(duì)11種細(xì)菌的抑菌效果總體要強(qiáng)于其余6種苔蘚植物醇提液的抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)粗葉青毛蘚醇提液、節(jié)莖曲柄蘚醇提液具有廣泛的抑菌性，且粗葉青毛蘚醇提液對(duì)化膿性鏈球菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌抑菌效果明顯，節(jié)莖曲柄蘚醇提液對(duì)銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌抑菌效果明顯，但目前未將粗葉青毛蘚和節(jié)莖曲柄蘚列為藥用苔蘚植物[14-17]?？梢?jiàn)還需對(duì)苔蘚植物進(jìn)行抗菌性篩查，以期找出既能廣泛抗菌且抗菌效果好的苔蘚植物，及時(shí)對(duì)這些苔蘚植物資源進(jìn)行保護(hù)。

節(jié)莖曲柄蘚和檜葉白發(fā)蘚對(duì)11種細(xì)菌的抑菌性達(dá)到高度統(tǒng)一，說(shuō)明它們的次生代謝產(chǎn)物有著很大的相似性，賈渝、何思也在2013年的《中國(guó)生物物種名錄》（第一卷苔蘚植物）中將曲柄蘚屬放在了白發(fā)蘚科中[18]。泥炭蘚和卵葉泥炭蘚同屬泥炭蘚屬，在供試的11種細(xì)菌中，它們對(duì)8種細(xì)菌是否有抑菌作用是統(tǒng)一的，可見(jiàn)它們的次生代謝產(chǎn)物種類既具相似性，但又有區(qū)別。

從8種苔蘚植物醇提液抑菌活性來(lái)看，與對(duì)照組相比有顯著差異的并不是大多數(shù)，只有一部分種類的醇提取液抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，此結(jié)果與王丹對(duì)67種苔蘚植物的抑菌活性研究有相似性[19]。11種細(xì)菌中，傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌對(duì)8種苔蘚植物醇提液最為敏感，8種苔蘚植物醇提液均對(duì)其有抑制作用。8種苔蘚植物醇提液對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌效果最好，抑菌效果與對(duì)照組相比有顯著差異。

苔蘚植物有抑菌性的主要原因是能產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，蘚類的主要次生代謝產(chǎn)物為黃酮、三萜、甾醇化物和長(zhǎng)鏈不溶性脂肪酸等。從本次實(shí)驗(yàn)還可以看出，苔蘚植物中確實(shí)含有某些抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，且部分物質(zhì)可以溶于有機(jī)溶劑乙醇中，后繼應(yīng)對(duì)有明顯抗菌作用的苔蘚植物做更進(jìn)一步的研究，以期篩選出新的藥用苔蘚植物。