邵攀峰 尹忠良 孫慶霞 李少麗 朱國(guó)坡

（杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司，浙江杭州 310018）

流行性乙型腦炎（Epidemic encephalitis），又稱日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JVE ），簡(jiǎn)稱乙腦，是由黃病毒科（Flaviridae）黃病毒屬乙型腦炎病毒而引起的一種嚴(yán)重威脅人畜健康的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病大多數(shù)動(dòng)物成隱性感染，病毒通常在蚊-豬-蚊等動(dòng)物間循環(huán)，豬被認(rèn)為是JEV最重要的自然增殖動(dòng)物[1]。豬還是JEV的重要貯存宿主和傳染源，人的感染大多是豬群感染JEV經(jīng)蚊傳播而引致的[2]。我國(guó)對(duì)JEV的研究大多集中在人源和蚊源株，對(duì)豬源JEV的報(bào)道較少[3]。因此，加大對(duì)豬源乙型腦炎病毒研究不僅有利于豬傳染病防控，而且對(duì)人類乙型腦炎病的防控也具有重要的公共衛(wèi)生意義。

本研究采集疑似豬乙型腦炎發(fā)病養(yǎng)豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒病料組織，取RT-PCR檢測(cè)陽性樣品，經(jīng)過在BHK-21細(xì)胞繼代培養(yǎng)、病毒含量測(cè)定、病毒中和試驗(yàn)、小鼠致死量測(cè)定等試驗(yàn)研究，最終確定分離獲得1株豬乙型腦炎病毒，現(xiàn)將研究情況報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料

采集妊娠母豬流產(chǎn)胎兒腦組織樣品6份，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞及血清

BHK-21細(xì)胞、豬乙型腦炎特異性陽性血清均由杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司制備和保存。

1.3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自GIBCO公司；Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑 盒（RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0）、DNA Marker、10×PCR Buffer、Taq 酶、dNTP 等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

2 方法

2.1 病毒分離

取流產(chǎn)胎兒病料組織，用無菌生理鹽水按1：5（W/V）比例勻漿后制成懸液，反復(fù)凍融3次，經(jīng)5000rpm離心5min，取上清、過濾除菌后-70℃ 凍存，備用。

對(duì)流產(chǎn)胎兒病料組織樣品用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit和RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0）試劑盒進(jìn)行核酸提取及反轉(zhuǎn)錄。利用本實(shí)驗(yàn)室建立的豬病PCR檢測(cè)方法進(jìn)行豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和豬乙型腦炎病毒篩查。檢測(cè)豬乙型腦炎病毒特異性引物 P1 5’-GCATCCCAAGCGAAGCAGGAGCC-3’，下游引物 P2 5’-AGCGTCCAATGTTGGTTTGTCG-3’，目的條帶 463 bp（E基因部分保守片斷），進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

2.2 病毒細(xì)胞培養(yǎng)

將豬乙型腦炎病毒RT-PCR檢測(cè)為陽性的組織樣品按1.5% 比例接種到BHK-21細(xì)胞上，35 ℃ 吸附60 min，補(bǔ)加入維持液，置35 ℃，5% CO2培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察BHK-21細(xì)胞CPE，培養(yǎng)至96 h或細(xì)胞病變達(dá)75%左右時(shí)將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次收獲，連續(xù)繼代培養(yǎng)，觀察乙腦病毒對(duì)BHK-21細(xì)胞的病變情況。

2.3 病毒含量的測(cè)定

取病毒液用含2% 新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10-1～10-7稀釋度，每個(gè)稀釋度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上已長(zhǎng)成良好單層的BHK-21細(xì)胞4孔，0.4ml/孔；同時(shí)設(shè)不接毒的正常細(xì)胞對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃、5% CO2條件下吸附90min，吸附結(jié)束后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，再每孔加入含1% 甲基纖維素的2% 新生牛血清DMEM培養(yǎng)液4.0ml，繼續(xù)置35℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5日，然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，每孔加入固定液（含2.5%重鉻酸鉀以及5% 冰醋酸的5% 福爾馬林溶液）2.0ml室溫處理30min，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，再每孔加入1% 結(jié)晶紫染色工作液2.0ml室溫染色20min，棄去結(jié)晶紫染色液并用PBS緩沖液（0.015mol/L，pH7.4～7.6）輕輕沖洗3次晾干，當(dāng)細(xì)胞對(duì)照無蝕斑出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行蝕斑計(jì)數(shù)，選取每孔蝕斑數(shù)在10～100之間的稀釋度為基準(zhǔn)計(jì)算病毒含量（PFU/ml）。

2.4 病毒中和試驗(yàn)

將病毒液用含2% 新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至200PFU/0.4ml，與等量乙型腦炎病毒陽性血清混合后，置37℃中和90min，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上已長(zhǎng)成良好單層的BHK-21細(xì)胞4孔，0.4ml/孔；同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照孔4孔，每孔接種同條件處理的病毒與含2% 新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液混合液0.4ml；正常細(xì)胞對(duì)照孔4孔，每孔加入含2% 新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液0.4ml。將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃、5% CO2條件下吸附90分鐘，吸附結(jié)束后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，再每孔加入含1% 甲基纖維素的2% 新生牛血清DMEM培養(yǎng)液4.0ml，繼續(xù)置35℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5日，然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，每孔加入固定液（含2.5%重鉻酸鉀以及5% 冰醋酸的5% 福爾馬林溶液）2.0ml室溫處理30min，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，再每孔加入1% 結(jié)晶紫染色工作液2.0ml室溫染色20min，棄去結(jié)晶紫染色液并用PBS緩沖液（0.015mol/L，pH 7.4～7.6）輕輕沖洗3次，晾干后用于進(jìn)行蝕斑觀察。

2.5 小鼠致病力試驗(yàn)

將病毒液用DMEM培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7這3個(gè)適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度腹腔接種11～13g SPF小鼠5只，0.3ml/只。觀察14日，記錄各組小鼠死亡數(shù)量，按Reed-Muench法計(jì)算LD50。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒分離

進(jìn)行豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒和豬乙型腦炎病毒核酸物質(zhì)PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，6份樣品中豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒的病原PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。6份樣品進(jìn)行乙型腦炎病毒RT-PCR檢測(cè)，有1份樣品擴(kuò)增出明顯條帶，有2份樣品擴(kuò)增條帶亮度微弱，擴(kuò)增出目的條帶大小相符（463 bp），而陰性對(duì)照無條帶（圖1）。

圖1 豬乙型腦炎病毒RT-PCR結(jié)果

3.2 病毒細(xì)胞培養(yǎng)

RT-PCR檢測(cè)豬乙型腦炎病毒陽性的3份病料組織樣品，接種BHK-21細(xì)胞，并進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察BHK-21細(xì)胞病變，結(jié)果表明，只有1號(hào)樣品能造成BHK-21細(xì)胞明顯而穩(wěn)定的細(xì)胞病變，將1號(hào)樣品命名為JEV（A6株）。

3.3 病毒含量的測(cè)定

JEV（A6株）經(jīng)過在BHK-21細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代，結(jié)果表明，隨著病毒在細(xì)胞傳代適應(yīng)，病毒含量不斷提高，病毒含量可達(dá)到106.6PFU/ml。（表1）

表1 不同代次豬乙型腦炎病毒含量測(cè)定結(jié)果

3.4 病毒中和試驗(yàn)

將病毒液用含2% 新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至200PFU/0.4ml，與等量乙型腦炎病毒陽性血清混合后接種BHK-21細(xì)胞。結(jié)果表明，JEV（A6株）病毒對(duì)照孔4/4出現(xiàn)CPE；JEV（A6株）與乙型腦炎病毒陽性血清中和均未出現(xiàn)CPE孔；正常細(xì)胞對(duì)照孔4/4未出現(xiàn)CPE，結(jié)果表明JEV（A6株）能夠被乙型腦炎病毒陽性血清特異性中和。

3.5 小鼠致死量測(cè)定試驗(yàn)

攻毒后觀察14日，記錄各組小鼠死亡數(shù)量，按Reed-Muench法計(jì)算LD50（表2）。結(jié)果表明，JEV（A6株）能引起小鼠表現(xiàn)有痙攣、戰(zhàn)栗、肢體麻痹等腦炎典型發(fā)病癥狀，并且可以造成死亡。

4 討論

乙型腦炎病的研究大多集中在人源和蚊源，然而豬被認(rèn)為是JEV最重要的自然增殖動(dòng)物[1]。豬還是JEV的重要貯存宿主和傳染源，病毒通常在蚊-豬-蚊等動(dòng)物間循環(huán)。目前國(guó)內(nèi)豬乙型腦炎病防控只有豬乙型腦炎活疫苗（SA14-14-2株）在售，并且乙型腦炎病毒（SA14-14-2株）也一直用于人乙型腦炎病的防控，存在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)值得思考。雖然目前豬乙型腦炎活疫苗（SA14-14-2株）在豬的應(yīng)用上安全、有效，但是研制開發(fā)動(dòng)物專用乙型腦炎疫苗，豐富動(dòng)物用乙型腦炎疫苗類別比如豬乙型腦炎滅活疫苗和基因工程疫苗的研發(fā)與應(yīng)用，這樣更有利于乙型腦炎病的長(zhǎng)期防控和凈化。

本研究從豬乙型腦炎發(fā)病養(yǎng)豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒病料分離獲得1株豬乙型腦炎病毒JEV（A6株）。JEV（A6株）能夠在BHK -21細(xì)胞上穩(wěn)定增殖產(chǎn)生細(xì)胞病變，經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)后病毒含量可達(dá)到106.6PFU/ml。JEV（A6株）能引起小鼠表現(xiàn)有痙攣、戰(zhàn)栗、肢體麻痹等腦炎典型發(fā)病癥狀，并且可以造成死亡。本研究為進(jìn)一步開展豬乙型腦炎滅活疫苗及相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。