羅愛國，王家彥,2，郝建偉，郭春燕，時曉麗，楊博雯，趙紅梅*

(1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 晉中 030619；2.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇 南通 226019)

山西老陳醋風(fēng)味鮮美，功效豐富，是深受人們喜愛的調(diào)味品，但在釀醋過程中會不可避免地產(chǎn)生副產(chǎn)物——醋糟。醋糟是原料釀醋后得到的固態(tài)殘渣，產(chǎn)量巨大[1-2]。目前山西年產(chǎn)80多萬噸醋，將產(chǎn)生56萬噸左右的醋糟[3]。由于自身含水量大，雜質(zhì)較多，不及時處理會造成醋糟變質(zhì)，進(jìn)而污染環(huán)境[4]，因此，及時開發(fā)利用醋糟是研究人員一直關(guān)注的問題。近年來，微生物發(fā)酵醋糟制備發(fā)酵飼料、制備能源等已經(jīng)成為一種熱潮[5]，而微生物是發(fā)酵醋糟的核心。

利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)解析微生物菌群只能分離鑒別少數(shù)菌種[6-7]，而且分析序列的速度慢、規(guī)模小且精度低[8]，而應(yīng)運而生的高通量測序技術(shù)則能快速、大量、全面地對微生物菌群序列進(jìn)行分析[9-11]，因此近年來此技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于分析微生物的豐富度和多樣性[12]。但目前幾乎沒有利用高通量測序技術(shù)對醋糟微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的研究報道,只有些應(yīng)用于食醋方面的研究，張永杰等基于高通量測序技術(shù)分析了釀醋過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)，其中釀酒酵母和黑曲霉是發(fā)酵階段的優(yōu)勢真菌[13]。欒春光等利用高通量測序技術(shù)分析了漲壺食醋中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)微生物主要分布于厚壁菌門、廣古菌門和變形菌門，其中厚壁菌門中的乳酸菌屬占絕對優(yōu)勢[14]。

因此，本研究利用高通量測序技術(shù)，通過收集醋糟樣品、提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增、高通量測序及數(shù)據(jù)分析等流程，解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，為建立山西老陳醋丟糟微生物信息數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步開發(fā)利用醋糟提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

山西老陳醋丟糟：由晉中市榆次區(qū)宇超醋廠提供。

1.2 試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA M5635-02)；Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒(Life Q10212)；2×Hieff?Robust PCR Master Mix(Yeasen 10105ES03)；Hieff NGSTMDNA Selection Beads(Yeasen 12601ES56)。

1.3 主要儀器

Pico-21臺式離心機(jī) ThermoFisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；Invitrogen Q32866 Qubit?3.0熒光計；ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品準(zhǔn)備與預(yù)處理

收集10 g山西老陳醋丟糟，立即粉碎后密封于無菌袋中，并編號醋糟樣品為CZ，保存于-80 ℃?zhèn)溆肹15]。

1.4.2 醋糟樣品基因組DNA提取

取粉碎混勻后的醋糟樣品0.2～0.3 g，按照OMEGA試劑盒的使用要求和說明對醋糟微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取，用0.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取DNA的完整性[16]，用Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒檢測提取 DNA 的濃度[17]，DNA樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆肹18]。

表1 質(zhì)檢結(jié)果

質(zhì)檢結(jié)果表明，樣品能進(jìn)行下一步擴(kuò)增。

1.4.3 ITS1-ITS2區(qū)域PCR擴(kuò)增

第一輪擴(kuò)增：用于PCR反應(yīng)過程中的DNA總量可通過Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒進(jìn)行精確定量。利用引物(ITS1F和ITS2R)對真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。

表2 ITS區(qū)引物序列

于無菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系，見表3。混勻并將反應(yīng)離心于管底。

表3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：首先94 ℃預(yù)變性3 min；接著進(jìn)入下一步流程并重復(fù)5次，包括94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s；然后在94 ℃高溫條件下變性20 s，55 ℃低溫下退火20 s，72 ℃中溫下延伸30 s，該步驟共重復(fù)20次后于72 ℃再延伸5 min，第一輪擴(kuò)增結(jié)束。

第二輪擴(kuò)增：引入Illumina橋式PCR兼容引物。于無菌PCR管中(200 μL)配制反應(yīng)體系，見表4。

表4 PCR反應(yīng)體系

將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件:95 ℃，3 min→(高溫94 ℃，20 s→低溫55 ℃，20 s→中溫72 ℃，30 s)→72 ℃，5 min(不同溫度下反應(yīng)原理同第一步)。擴(kuò)增結(jié)束后，2%瓊脂糖電泳檢測產(chǎn)物。

醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見圖1，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增效果較好，滿足后續(xù)測序?qū)嶒灥囊蟆?/p>

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

1.4.4 16S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增

第一輪擴(kuò)增：用于PCR反應(yīng)過程中的DNA總量可通過Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒來精確地定量。利用引物(341F和805R)對細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表5。

表5 16S區(qū)引物序列

其余反應(yīng)體系與實驗過程同2.4.3流程。

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖電泳檢測其產(chǎn)物。

醋糟樣品凝膠電泳顯示條帶見圖2，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增效果較好，滿足后續(xù)測序?qū)嶒灥囊蟆?/p>

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

1.4.5 高通量測序

真菌ITS1-ITS2以及細(xì)菌16S rDNA V3-V4的測序過程委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

高通量測序原始序列得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，且序列中含有起始加入的引物接頭序列以及barcode標(biāo)簽序列。

首先需要對引物接頭序列進(jìn)行去除，然后根據(jù)雙端序列之間的重復(fù)關(guān)系，將所有成對的序列拼接成一條序列，再根據(jù)barcode標(biāo)簽序列區(qū)分醋糟樣品中真菌及細(xì)菌的各序列數(shù)據(jù)，之后對各序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，如對小于150 bp的短序列，低復(fù)雜度及低質(zhì)量序列等進(jìn)行過濾[19]，最后得到各序列的有效數(shù)據(jù)，即有效序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的拼接

醋糟樣品經(jīng)分析后得到真菌、細(xì)菌的原始序列分別為64558，62542條，平均長度分別為199.26，460.54 bp；經(jīng)拼接、質(zhì)控過濾后，得到的有效序列分別為64558，62382條，平均長度分別為157.26，422.87 bp。真菌，細(xì)菌的序列有效率分別為100%、99.75%。

表6 醋糟樣品中有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 樣品OTU分類

97%相似水平下對醋糟樣品中真菌及細(xì)菌各序列進(jìn)行聚類分析劃分操作分類單元(OTU)[20]，其中醋糟樣品中真菌有33個OTU 序列，細(xì)菌有95個OTU序列。由此可以看出，醋糟中細(xì)菌的微生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌。

2.3 樣品OTU物種統(tǒng)計

以門、綱、目、科、屬、種的順序依次將醋糟中OTU進(jìn)行分類信息統(tǒng)計。

由表7可知，醋糟樣品中的真菌菌群分布在3個門、7個綱、10個目、16個科、20個屬、29個種中；細(xì)菌菌群分布在7個門、11個綱、22個目、39個科、56個屬中。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，醋糟中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

表7 醋糟樣品各類水平OTU物種統(tǒng)計

2.4 Rank-abundance曲線

對比圖3，由圖4 Rank-abundance曲線可知，圖4中的曲線更寬，更平緩，說明組成醋糟的菌群中，細(xì)菌菌群的豐富程度、均勻程度均高于真菌菌群。

圖3 ITS(真菌)Rank-abundance曲線圖

圖4 16S(細(xì)菌)Rank-abundance曲線圖

2.5 α多樣性分析

研究樣品中微生物的多樣性常用Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)4個多樣性指數(shù)進(jìn)行描述。其中，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)被用來描述物種的組成多樣性；ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)被用來描述物種的豐富度。覆蓋率可以反映本次實驗的取樣能否代表樣品的真實情況。若覆蓋率>97%，則證明實驗的取樣可以反映樣品中微生物的分布情況。

由表8和表9中的覆蓋率可知，實驗測定的序列數(shù)已足夠大，說明實驗的取樣能夠真實反映醋糟樣品中的真核以及原核微生物的分布情況。

表8 醋糟真菌群落多樣性指數(shù)

表9 醋糟細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

對比表8和表9數(shù)據(jù)可知，醋糟中真菌的Shannon 指數(shù)值、ACE指數(shù)值、Chaol值均低于細(xì)菌中相對應(yīng)的值，而Simpson指數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌中的Simpson指數(shù)值。這表明醋糟中真菌的物種多樣性和豐富度均低于細(xì)菌，即醋糟中的原核微生物多樣性高于真核。

2.6 稀釋性曲線分析

由圖5和圖6可知，隨著隨機(jī)抽取測序數(shù)目的增多，曲線逐漸走向平緩，說明測序數(shù)目足夠大，更多的測序不會產(chǎn)生更多的OTU，測序數(shù)量足夠合理，并且從兩條曲線在縱軸上的最大截距可知，醋糟樣品中細(xì)菌菌群的OTU數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于真菌菌群，即醋糟中細(xì)菌菌群多樣性高于真菌。

圖5 ITS(真菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

圖6 16S(細(xì)菌)Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

2.7 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

由圖7和圖8可知，隨著測定序列數(shù)目的逐步增加，曲線走向平緩，說明了測序的深度合理。對比真菌、細(xì)菌的Shannon指數(shù)值，可知醋糟樣品中細(xì)菌的物種多樣性高于真菌。

圖7 ITS(真菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

圖8 16S(細(xì)菌)香農(nóng)指數(shù)曲線

2.8 基于門和屬水平的真菌菌群分類

醋糟樣品中真菌共有33個OTU序列。由圖9可知，醋糟中真核微生物由子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)3個門組成。其中子囊菌門占比最大，為89.847%，其次為擔(dān)子菌門，占比10.152%，最后是毛霉菌門，占比0.001%。分析數(shù)據(jù)，以豐度>1%為閾值，共得到2個門。分別是子囊菌門(Ascomycota，89.847%)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota，10.152%)。

圖9 真菌門水平分布圖

分析測得數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，以豐度>0.01%為閾值，醋糟樣品共得到4個屬；以豐度>0.5%為閾值，醋糟樣品共得到4個屬；以豐度>1%為閾值，醋糟樣品共得到4個屬。由圖10可知，醋糟樣品中的真核微生物由畢赤酵母屬(Pichia，85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon，9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus，3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida，1.02%)以及一些豐度小于1%的真菌菌屬組成。

圖10 真菌屬水平分布圖

由此可以看出，在真菌屬水平組成上，醋糟中的優(yōu)勢真菌為畢赤酵母屬，其次為毛孢子菌屬，最后是雙足囊菌屬和假絲酵母菌屬，其中畢赤酵母屬為醋糟中的絕對優(yōu)勢真菌菌屬；同時醋糟中還有一些豐度小于1%的真核微生物菌屬，它們在醋糟真菌中的占比小，不屬于優(yōu)勢真菌。

2.9 基于門和屬水平的細(xì)菌菌群分類

醋糟樣品中的細(xì)菌共有95個OTU序列。由圖11可知，醋糟樣品中的細(xì)菌菌群主要由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門組成，還有一些豐度小于1%的細(xì)菌菌門。其中以豐度>0.01%為閾值，共得到5個門；以>1%為閾值，共得到3個門，分別是厚壁菌門(Firmicutes，61.64%)、變形菌門(Proteobacteria，35.96%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，2.03%)。

圖11 細(xì)菌門水平分布圖

由圖12可知，醋糟樣品中的原核微生物由乳桿菌屬、醋菌屬、小球菌屬、嗜冷桿菌屬、金黃桿菌屬，還有一些未得到分類的菌屬以及豐度小于1%的菌屬組成。分析數(shù)據(jù)結(jié)果，其中以豐度>0.01%為閾值，醋糟樣品共得到19個屬；以豐度>0.5%為閾值，共得到10個屬；以豐度>1%為閾值，共得到7個屬，分別是乳桿菌屬(Lactobacillus，47.29%)、醋菌屬(Acetobacter，27.31%)、小球菌屬(Pediococcus，7.74%)、未分類的乳桿菌屬(unclassified_Lactobacillales，6.11%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，3.2%)、未分類的腸桿菌科(unclassified_ Enterobacteriaceae，2.45%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，1.32%)。

圖12 細(xì)菌屬水平分布圖

由此可以看出，醋糟中的原核微生物中占最大優(yōu)勢的是乳桿菌屬，其次是醋菌屬，同時含有一定數(shù)量的小球菌屬以及其他菌類。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測序技術(shù)解析了山西老陳醋丟糟中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，同時也對醋糟中真核微生物以及原核微生物的多樣性及豐富度進(jìn)行了分析。從醋糟樣品中得到的真菌及細(xì)菌OTU序列分別有33個和95個。

以門為水平分析醋糟樣品中的真核及原核微生物。結(jié)果表明，醋糟中的真菌最主要分布于子囊菌門(Ascomycota，89.847%)，其次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota，10.152%)；細(xì)菌主要分布于厚壁菌門(Firmicutes，61.64%)，其次為變形菌門(Proteobacteria，35.96%)，最后為擬桿菌門(Bacteroidetes，2.03%)。

以屬為水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢真菌有畢赤酵母屬(Pichia，85.37%)、毛孢子菌屬(Trichosporon，9.76%)、雙足囊菌屬(Dipodascus，3.4%)、假絲酵母菌屬(Candida，1.02%)；樣品中豐度大于1%的優(yōu)勢細(xì)菌有乳桿菌屬(Lactobacillus，47.29%)、醋菌屬(Acetobacter，27.31%)、小球菌屬(Pediococcus，7.74%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，3.2%)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，1.32%)以及一些未得到分類學(xué)注釋的菌群。

該研究解析了山西老陳醋丟糟微生物菌群結(jié)構(gòu)，為將醋糟轉(zhuǎn)化為利用率更高的發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)，在進(jìn)一步開發(fā)利用醋糟資源，提供清潔、環(huán)保、無污染的環(huán)境中具有重要意義。