李大龍，徐倩倩，李興國

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

黑穗醋栗(RibesnigrumL.)是一種小型多年生灌木，原產(chǎn)于中歐和北歐[1]，在我國產(chǎn)地主要集中在新疆和黑龍江兩地區(qū)[2]，黑穗醋栗富含楊梅素、槲皮素和山奈酚等黃酮類次生代謝產(chǎn)物，是一類眾所周知的對人體健康有益的非營養(yǎng)植物化學(xué)物質(zhì)[3]。黃酮具有抗氧化活性和抗菌活性[4-5]，在抗腫瘤和抗癌方面具有一定的功效且毒副作用較小[6]，在體內(nèi)是餐后葡萄糖反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑[7]，同時具有抗糖尿病和抗動脈粥樣硬化的功能[8-9]。

近年來，已有多篇研究報道了從不同植物中提取黃酮的方法，包括有機(jī)溶劑提取法[10]、微波輔助提取法[11]、超聲波輔助提取法[12-13]、酶法提取[14]等。在提取黑穗醋栗中黃酮的過程中，提取溫度超過50 ℃極易破壞黃酮的結(jié)構(gòu)和活性[15]。超聲波輔助法主要是利用超聲波產(chǎn)生的空化作用，破壞植物細(xì)胞壁并使其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，具有提取溫度低、操作簡便、收率高、無污染等優(yōu)點[16]。目前雖有利用超聲波輔助法提取黑穗醋栗葉片中黃酮的報道，但利用超聲波輔助提取黑穗醋栗中黃酮的方法還未見報道，本試驗利用超聲波輔助法低溫提取黑穗醋栗中黃酮，保證了提取物結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，為黑穗醋栗黃酮的提取產(chǎn)業(yè)化提供了理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

黑穗醋栗：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站，洗凈瀝干后冷凍于冰箱待用。

1.2 試劑

蘆?。褐袊幤飞镏破窓z定所；無水乙醇、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁等：均為分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器設(shè)備

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CX-500型超聲波清洗機(jī) 北京醫(yī)療設(shè)備二廠；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司；JY92-2D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 黑穗醋栗中黃酮含量的測定

本試驗以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮的含量[17]，蘆丁濃度c與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程式為：A=13.986c+0.0032，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。黃酮總質(zhì)量計算方法見公式(1)和公式(2)：

M1=P·c·V。

(1)

M2=M1/m。

(2)

式中：M1為黃酮質(zhì)量(mg)，V為定容體積(mL)，c為黃酮提取液濃度(mg/mL)，P為提取液稀釋倍數(shù)，M2為黃酮提取量(mg/g)，m為黑穗醋栗質(zhì)量(g)。

1.4.2 超聲波輔助法最佳提取工藝的確定

用組織搗碎勻漿機(jī)將黑穗醋栗打碎為勻漿并準(zhǔn)確稱取5.0000 g，按設(shè)定的液料比加入95%乙醇，將超聲波輔助提取后所得的粗提液進(jìn)行過濾，濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，所得固形物用超純水溶解后用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，濃縮后的粗產(chǎn)物用95%乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用1.4.1中方法測定黃酮含量，確定最佳提取工藝。

1.4.3 單因素試驗

分別選擇提取液料比、提取時間和超聲波功率3個因素的不同條件進(jìn)行試驗，考察其對黃酮提取量的影響，每項試驗重復(fù)3次，具體方案見表1。

表1 超聲波輔助提取法單因素試驗表

1.4.4 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，以黃酮提取量為考察指標(biāo)，采用三因素三水平正交試驗表L9(33)設(shè)計試驗，具體方案見表2。

表2 超聲波輔助提取法正交試驗因素水平表

1.4.5 黑穗醋栗黃酮對油脂抗氧化性的研究

配制0.01 mol/L的Na2S2O3溶液：準(zhǔn)確稱取1.2429 g Na2S2O3·5H2O，溶解后定容于500 mL容量瓶中待用。分別稱取20 g豆油置于2個具塞三角瓶內(nèi)，向其中一瓶中加入5 mL黃酮提取液，另一瓶中加入5 mL 95%乙醇進(jìn)行對照。分別從2個三角瓶中稱取1 g油樣置于碘量瓶中，加入25 mL氯仿∶冰乙酸(2∶3)混合溶液，再加入1 mL飽和KI溶液，加塞密閉搖勻，避光靜置30 min。向碘量瓶中加入50 mL蒸餾水，以淀粉作為指示劑，用0.01 mol/L的Na2S2O3溶液滴定至終點，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。POV值計算方式見公式(3)：

(3)

式中：POV為過氧化值(meq/kg)，c為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)，V為消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)，m為取樣質(zhì)量(g)。

將三角瓶中的剩余試樣置于(60±0.5)℃的恒溫箱中，隔1 d測定和記錄一次過氧化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑穗醋栗中黃酮含量的測定

2.1.1 吸收波長的確定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后在400～600 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖

由圖1可知，顯色絡(luò)合物在503 nm處有最大吸收波長，因此選擇503 nm為本試驗的測定波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置于試管中，顯色后在503 nm處測定吸光度值，結(jié)果見表3。

表3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果

以濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。蘆丁濃度c與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程式為：A=13.986c+0.0032，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 提取液料比的確定

在超聲波功率300 W、超聲時間30 min的條件下，考察不同液料比(4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1，mL/g)對黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取液料比對提取量的影響

由圖3可知，液料比在4∶1～12∶1的范圍內(nèi)，黃酮的提取量與液料比呈正相關(guān)，當(dāng)液料比超過8∶1時，提取量的增加變緩，12∶1時達(dá)到最大值，超過12∶1時開始下降。隨著提取溶劑的增加，溶出的物質(zhì)包括黃酮化合物和雜質(zhì)均在增加，影響了黃酮化合物的提取量。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇液料比10∶1、12∶1、14∶1(mL/g)進(jìn)行正交試驗。

2.2.2 超聲波提取時間的確定

在超聲波功率300 W、提取液料比10∶1(mL/g)的條件下，考察不同提取時間(10，20，30，40，50，60 min)對黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時間對提取量的影響

由圖4可知，超聲波時間在10～40 min范圍內(nèi)，黃酮的提取量與提取時間呈正相關(guān)，40 min時達(dá)到最大，超過40 min開始下降。隨著提取時間的增加，溶出的黃酮化合物與空氣接觸時間也在增加，加速了其被氧化的過程，因此黃酮化合物的提取量下降。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇提取時間30，40，50 min進(jìn)行正交試驗。

2.2.3 超聲波功率的確定

在液料比10∶1(mL/g)、超聲時間30 min條件下，考察不同超聲波功率(200，300，400，500，600，700，800 W)對提取量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 超聲波功率對提取量的影響

由圖5可知，超聲波功率在200～400 W范圍內(nèi)，黃酮的提取量與超聲波功率呈正相關(guān)，400 W時達(dá)到最大，超過400 W提取量緩慢下降。超聲波功率過高會破壞黃酮化合物的活性結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)在適宜的超聲波功率下進(jìn)行黃酮的提取。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇超聲波功率300，400，500 W進(jìn)行正交試驗。

2.3 正交試驗結(jié)果分析

通過單因素試驗，選擇提取液料比(10∶1、12∶1、14∶1，mL/g)、超聲波提取時間(30，40，50 min)、超聲波功率(300，400，500 W)進(jìn)行三因素三水平正交試驗，結(jié)果見表4。

表4 超聲波輔助提取法正交試驗結(jié)果

利用SAS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，確定本試驗的最佳工藝條件，分析結(jié)果見表5和表6。

表5 超聲波輔助提取法的極差分析表

表6 超聲波輔助提取法的方差分析表

由表5可知，本試驗討論的3個因素對提取量影響的顯著順序為C>A>B，即超聲波功率對試驗結(jié)果的影響最顯著，液料比的影響次之，超聲時間的影響最小。確定超聲波輔助法的最佳提取工藝為A3B1C2，即提取液料比12∶1(mL/g)，超聲時間30 min，超聲波功率400 W，此條件下提取量為0.728 mg/g。

由表6可知，本試驗?zāi)Ｐ椭蠪=277.16，概率P=0.0036，小于臨界值α(0.05)且小于0.01，具有極顯著性。在本試驗討論的3個因素中，A(提取液料比)的概率P=0.0099，對試驗的影響具有極顯著性；B(提取時間)的概率P=0.0349，具有顯著性；C(超聲波功率)的概率P=0.0014，具有極顯著性。

2.4 黑穗醋栗黃酮對油脂抗氧化作用的試驗結(jié)果

黑穗醋栗黃酮對油脂抗氧化作用的試驗結(jié)果見圖6。

圖6 黃酮對油脂過氧化值的影響

由圖6可知，豆油在正常條件下會被氧化，過氧化值升高。加入黑穗醋栗黃酮后，過氧化值緩慢升高，表明黑穗醋栗中黃酮對豆油的氧化有抑制作用。

3 結(jié)論

本研究以黑穗醋栗為原料，采用超聲波輔助法進(jìn)行提取試驗，通過單因素試驗及三因素三水平L9(33)正交試驗確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，在單因素試驗中液料比、提取時間和超聲波功率隨著因素水平的增加均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。在正交試驗中，由極差分析可知，3個因素對黃酮提取的影響大小為超聲波功率>液料比>超聲時間。超聲波輔助提取法提取黑穗醋栗中黃酮的最佳提取條件為：提取液料比12∶1(mL/g)，提取時間30 min，超聲波功率400 W，此條件下黃酮的提取量為0.728 mg/g。對黃酮抗氧化能力進(jìn)行測定，結(jié)果表明，黃酮對豆油的氧化有抑制作用，具有抗氧化活性，故可在食品中添加黑穗醋栗黃酮起到抗氧化作用，從而延長食品的貯存時間。