李樹(shù)森，肖然，孫二娜，任怡鎂，王辰元

（1.蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司，北京 101100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100191）

益生元是指能夠通過(guò)選擇性地促進(jìn)人體腸道內(nèi)某種或某幾種微生物生長(zhǎng)或發(fā)揮其活性，且不被人體所消化的食物成分[1]。廣義的益生元包括低聚糖、植物多酚、小分子蛋白和維生素等[2]。其中水溶性低聚糖是目前研究和使用最多的益生元類型。已有研究證明攝入一定劑量的益生元可以顯著改善宿主體內(nèi)腸道環(huán)境，提升腸道益生菌的比例[3]。

除單獨(dú)使用外，益生元與特定益生菌組合可以形成合生元，其生物活性要強(qiáng)于單獨(dú)的益生菌或益生元[4]。合生元中的低聚糖能夠特異性地促進(jìn)組合中的益生菌生長(zhǎng)，促進(jìn)其代謝產(chǎn)物分泌[5]。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是目前最常用的益生菌，菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖是最為常見(jiàn)的與其搭配的益生元[6,7]。除此之外，低聚木糖和低聚甘露糖雖然在合生元制劑中使用較少，但有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)雙歧桿菌的益生活性高于常見(jiàn)的其他益生元，因此對(duì)其與相應(yīng)益生菌協(xié)同增效的研究也日益增多[8,9]。

以往對(duì)益生菌、益生元發(fā)酵特性的研究是通過(guò)單一菌株發(fā)酵體系來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。這種方法能較好地分析二者間的作用關(guān)系，但卻缺乏腸道內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的評(píng)價(jià)維度，無(wú)法真實(shí)模擬體內(nèi)多菌群交互作用下合生元的促腸道益生菌增殖活性。近年來(lái)，隨著體外胃腸道模擬技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)階段對(duì)于消化道內(nèi)的化學(xué)環(huán)境模擬已能夠?qū)崿F(xiàn)，而對(duì)于消化道內(nèi)動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)的模擬還處于摸索階段[11]。Abbeele等人通過(guò)利用成人健康糞便在體外建立了結(jié)腸環(huán)境下的菌群模擬體系，研究比較了阿拉伯木糖和菊粉對(duì)菌群的調(diào)節(jié)作用[12]。該模型可以較好地反映多菌群環(huán)境下益生元對(duì)腸道益生菌的作用效果。但該體系與傳統(tǒng)合生元篩選方法是否存在結(jié)果上的差異還缺乏理論研究[13]。本研究通過(guò)建立結(jié)腸模擬發(fā)酵體系，分別比較了乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）發(fā)酵下和結(jié)腸模擬菌群微生態(tài)體系下5種低聚糖對(duì)益生菌的益生活性，以期通過(guò)本研究為合生元篩選的體外模型體系的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳雙歧桿菌MN-Gup（Bifidobacteriumanimalis subsp.lactisMN-Gup），由蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司提供；低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖和菊粉，純度在85%～90%，購(gòu)自保齡寶生物股份公司；低聚甘露糖，購(gòu)自西安源森生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq，購(gòu)自日本Takara公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限責(zé)任公司；菌群定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；SpectraMax多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 益生菌增殖活性的測(cè)定

將保存的乳雙歧桿菌MN-Gup菌株在無(wú)菌條件下接種到MRS完全培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)活化24h，然后再接種到MRS完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)活化24h，重復(fù)以上步驟活化3代。待菌種充分恢復(fù)活力后，取含有10mL MRS培養(yǎng)基的試管接種MN-Gup活化菌液，接種后使樣品中菌液濃度為1×108cfu/mL，然后分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖和菊粉，設(shè)定添加1.5%葡萄糖和無(wú)碳源培養(yǎng)基為對(duì)照組，厭氧培養(yǎng)24h。參考Palframan等人的方法[14]，用益生指數(shù)（Prebiotic index，PI）來(lái)表示每種益生元的益生活性，PI計(jì)算公式如下：

1.3 腸道微生態(tài)體外模擬模型的建立

參考石夢(mèng)玄等人的方法[15]，按磷酸氫二鉀3.5g/L、磷酸二氫鉀10.9g/L、碳酸氫鈉2g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨2g/L、黏蛋白1g/L、半胱氨酸0.5g/L、吐溫-80 2mL/L配制結(jié)腸模擬發(fā)酵液，按質(zhì)量比分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、低聚果糖、低聚甘露糖和葡萄糖，混勻后滅菌備用。

取3名成年人糞便稱重，混合后按1:5質(zhì)量比用生理鹽水進(jìn)行稀釋，漩渦震蕩。經(jīng)500g離心5min去除大的沉淀物，得菌群懸液。按8:1:1體積比依次添加結(jié)腸發(fā)酵液、菌群懸液和MN-Gup菌體懸液，使每組MNGup終濃度為1×108cfu/mL，然后以搖床37℃、轉(zhuǎn)速90厭氧培養(yǎng)8h。按DNA提取試劑盒操作步驟提取發(fā)酵液總DNA，并測(cè)定其DNA濃度。

1.4 腸道菌群增殖測(cè)定

參照Abbeele等人的方法，按表1所示設(shè)計(jì)引物[13]。取合成的擬桿菌屬（Bacteroidetes）、厚壁菌屬（Firmicutes）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp）、乳桿菌屬（Lactobacillusspp）和阿克曼菌屬（Akkermansiamuciniphila）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，按10倍比例稀釋為8個(gè)點(diǎn)，按1μL模板、上下游引物0.5μL、8μL水、10μLSYBR酶配制成20μL/孔的反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：95℃ 10min，60℃退火30s，72℃擴(kuò)增30s，40個(gè)循環(huán)，95℃熱變性15s，溶解曲線溫度95℃。以CQ值為縱坐標(biāo)、模板DNA濃度的Lg值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。相同條件下，根據(jù)下列公式計(jì)算樣品中目標(biāo)菌群的比例。

表1 腸道菌群菌屬PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，單因素方差分析（ANOVA）用于比較不同組之間的差異。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，a、b、c、d表示不同組之間的顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生元對(duì)乳雙歧桿菌MN-Gup增殖活性的影響

如圖1所示，本研究比較了不同益生元促乳雙歧桿菌MN-Gup增殖活性的差異，結(jié)果表明低聚半乳糖具有更顯著的促增殖活性，其PI值為2.18±0.19，其次為低聚木糖（1.68±0.15），低聚果糖和低聚甘露糖促增殖活性最低。PI可以反映不同益生元被特定菌株選擇性利用的程度，從該結(jié)果看乳雙歧桿菌MN-Gup對(duì)低聚半乳糖利用率更高，更適合作為其益生元搭配使用。

圖1 不同益生元對(duì)乳雙歧桿菌MN-Gup的益生指數(shù)

2.2 不同乳雙歧桿菌合生元組合對(duì)腸道益生菌生長(zhǎng)的影響

菌群中除雙歧桿菌外，乳桿菌屬也是主要的腸道有益菌[1]。如圖2所示，通過(guò)比較乳雙歧桿菌MN-Gup搭配不同益生元組合對(duì)糞便菌群中益生菌的影響發(fā)現(xiàn)，低聚木糖組合促雙岐作用顯著高于其他益生元，其對(duì)雙歧桿菌增殖的促進(jìn)效果是低聚半乳糖的6倍。即在體外模擬腸道微生態(tài)體系下，低聚木糖更適宜作為MN-Gup的合生元來(lái)調(diào)節(jié)腸道雙歧桿菌，而低聚半乳糖組則顯著提高了乳桿菌比例。

圖2 不同合生元組合對(duì)腸道益生菌比例的影響

本試驗(yàn)比較單一益生元對(duì)乳雙歧桿菌MN-Gup的益生效果時(shí)發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖促增殖最強(qiáng)，而在菌群中低聚木糖對(duì)雙岐菌屬的益生效果似乎更顯著。這可能是因?yàn)榫褐衅渌N類的雙歧桿菌對(duì)低聚木糖的利用率更高，具體原因需要進(jìn)一步分析。這也從側(cè)面反映出了多菌群體系下研究益生元的益生功能與單菌株發(fā)酵體系是可能存在差異的，相比較而言腸道微生態(tài)模擬體系可能更接近合生元在體內(nèi)作用時(shí)的真實(shí)環(huán)境。

2.3 不同乳雙歧桿菌合生元組合對(duì)腸道厚壁/擬桿菌群比例、阿克曼菌（AKK）生長(zhǎng)的影響

阿克曼菌被視為潛在的益生菌，研究表明其對(duì)機(jī)體慢性炎癥改善、肥胖和糖尿病的改善具有積極作用[16]。如圖3所示，各合生元組對(duì)AKK菌群占比影響不大，表明這5種低聚糖組合并不會(huì)顯著影響AKK菌群比例。與葡萄糖對(duì)照組相比，各合生元組均顯著增加了厚壁/擬桿菌群的比值，其中菊粉組效果最為顯著。

厚壁菌屬和擬桿菌屬兩者之和約占整個(gè)腸道菌群的90%，二者平衡對(duì)于腸道健康尤為重要[17]。當(dāng)厚壁菌屬占比較大時(shí)，機(jī)體容易發(fā)生肥胖；而擬桿菌屬占比增加則與腸炎和IBD的發(fā)生率呈正相關(guān)[18]。從圖3結(jié)果上看，各益生元組合均能夠提升厚壁/擬桿菌群比值，而菊粉組能顯著提升厚壁/擬桿菌群比例。目前還缺乏正常人群體內(nèi)厚壁/擬桿菌群比值與機(jī)體健康的關(guān)系，對(duì)于正常人來(lái)說(shuō)二者比值高低并不能直接判斷菌群是否健康，需要結(jié)合其他機(jī)體指標(biāo)和特征進(jìn)行甄別。

圖3 不同合生元組合對(duì)腸道AKK菌群和厚壁/擬桿菌群比例的影響

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了基于體外腸道微生態(tài)模擬方法的益生元篩選方法，通過(guò)提取成年人糞便菌群后進(jìn)行體外發(fā)酵，研究比較了不同合生元組合對(duì)腸道有益菌和重要菌群的調(diào)控作用，并與單菌株發(fā)酵體系的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明低聚木糖與乳雙歧桿菌MN-Gup組合后可顯著提升菌群中雙歧桿菌的比例，而單菌株發(fā)酵體系下低聚半乳糖更能促進(jìn)MN-Gup的生長(zhǎng)。各合生元組合對(duì)阿克曼菌的比例并無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果證明了體外腸道微生態(tài)模擬體系作為合生元篩選的新方法，可以從更多維度對(duì)合生元進(jìn)行篩選，后續(xù)可根據(jù)不同目的結(jié)合菌群特點(diǎn)，建立不同類型人群的體外篩選模式。