田峰 胡銅 吳昊天 祖力卡爾·阿地力 趙疆 涂來勇*

1.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000

2.新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊 830000

3.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊 830000

糖尿病可導致患者體內(nèi)代謝障礙，長期高血糖會造成多器官、多系統(tǒng)損害，在諸多靶器官中，“高血糖水平”與“骨穩(wěn)態(tài)”關系密切。長期高血糖狀態(tài)直接影響成骨分化與破骨分化的動態(tài)平衡，平衡一旦被打破，會造成骨質(zhì)疏松、骨折愈合延遲或不愈合。糖尿病患者的高血糖水平、晚期糖基化終末產(chǎn)物形成、胰島細胞的分泌功能、炎癥因子的釋放、氧化應激反應的上調(diào)、生長因子的代謝、成脂分化的激活、降糖藥物的干預等均可對骨微細結(jié)構(gòu)、骨皮質(zhì)的強度、成破骨分化的平衡產(chǎn)生影響[1-2]。二甲雙胍是目前臨床上治療糖尿病的一線治療藥物[3]。一項多中心研究[4]顯示，二甲雙胍治療可降低代表骨吸收的空腹骨轉(zhuǎn)換標志物，抑制骨吸收的活性，提示二甲雙胍可能對糖尿病患者骨骼的修復與重建起到有益的影響。二甲雙胍還可降低患者長骨與中軸骨的骨折率。前期研究顯示對于確診為糖尿病或前驅(qū)糖尿病的患者，二甲雙胍可以維持成破骨動態(tài)平衡，因此對骨穩(wěn)態(tài)具有保護作用[5-6]。有研究[7]報道二甲雙胍可以促進前成骨細胞和間充質(zhì)干細胞的分化，具有潛在的增強成骨分化作用。但二甲雙胍對骨髓源性巨噬細胞破骨分化的影響尚無定論。研究表明[8]，高糖環(huán)境可激活cAMP/PKA通路，直接調(diào)控核因子-KB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)的表達增加，通過RANKL/RANK/OPG通路刺激破骨細胞生成[9]。也有研究[10]得出完全不同的結(jié)論，即高糖環(huán)境上調(diào)Wnt通路激活cAMP/PKA通路從而抑制破骨分化。本研究擬通過體外實驗明確二甲雙胍對大鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDM)破骨分化的影響，進而通過體內(nèi)實驗觀察二甲雙胍對糖尿病模型鼠骨量的改善作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

鹽酸二甲雙胍片(格華止，0.85 g，中美上海施貴寶制藥有限公司)，STZ(鏈脲菌素，S0130，sigma)，血糖儀(580，魚躍)，血糖試紙(580，魚躍)。引物購自上海生工生物有限公司，引物序列見表1。一抗來源：CTSK(碧云天，AF6597)，C-FOS(碧云天，AF6489)，NFATC1(Abcam，ab155986)，TRAF6(碧云天，AF8223)，GAPDH(Abcam，ab8245)。一抗及二抗的濃度參照說明書使用。大鼠RANKL(Recombinant Rat TRANCE/RANK L/TNFSF11 Protein，9366-TN-025，R&D)，大鼠巨噬細胞集落刺激因子(Rat MCSF，96-400-28-2，Peprotech)。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建動物模型：選取24只8周齡健康雄性SPF級SD大鼠，體重(230±10)g，將大鼠隨機分籠，自由飲水，高脂飼料喂養(yǎng)，并保持飼養(yǎng)室環(huán)境良好，溫度24 ℃，濕度45 %～55 %，每天12 h光照、12 h黑暗交替，噪音不超過55分貝。適應性飼養(yǎng)一周后隨機分為3組，每組8只，分別為對照組、糖尿病模型組(模型鼠)、糖尿病模型+二甲雙胍(治療組)。一周后，所有大鼠在前一日晚8點禁食，保留足夠飲水，于次日晨8點開始構(gòu)建糖尿病模型。具體方法為：模型組一次性自左下腹腔注射STZ 60 mg /kg(STZ溶解于預冷的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，濃度調(diào)整為2 %)[11]，建立胰島功能損傷模型，正常組給予等體重劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模72 h后，禁食不禁水12 h，取大鼠尾靜脈血測血糖。具體方法為：用酒精棉擦凈大鼠鼠尾，用無菌剪刀剪斷鼠尾，去第一滴靜脈血，血糖試紙采集第二滴靜脈血，檢測血糖。當血糖≥16. 7 mmol /L，并出現(xiàn)飲水量、飼料消耗量明顯增多、尿量明顯增多等癥狀時，符合糖尿病診斷標準[12]，判定為糖尿病模型大鼠。倫理編號為TCMF1-20210521。

1.2.2動態(tài)指標監(jiān)測：造模成功后，每日早晨觀察大鼠狀態(tài)變化，包括毛發(fā)疏密、色澤、腹腔是否積液、耳釘是否脫落、鼠尾傷口是否清潔，每周測量體重。為監(jiān)測血糖水平，同時避免過多有創(chuàng)操作增加感染概率，每周測定血糖一次(斷尾取血法)。測血糖前禁食不禁水12 h。測完血糖后用酒精棉球擦凈鼠尾。每天保證充足的飼料及飲水，每天更換大鼠墊料及托盤，每周清洗飼養(yǎng)籠。

1.2.3給藥方式及藥物劑量：根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值，換算得出治療組SD大鼠每日二甲雙胍灌胃劑量為20 mg/只，對照組及模型組均給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥2個月。

1.2.4收集標本：行過量麻醉處死大鼠，取背部正中切口，剝離毛發(fā)及皮膚，完整收集下肢骨；取腹部正中切口，用紗布去除腹腔內(nèi)臟器，暴露椎體前緣，并擦拭干凈，完整收集L4椎體。剔除椎體及脛腓骨周圍肌肉及脂肪組織，浸沒在4 %多聚甲醛中，固定24 h。脫鈣處理14 d，制備石蠟切片，并嚴格按照操作流程制備HE染色、TRAP染色骨組織切片。

1.2.5大鼠BMDM的獲取：將8周齡SD大鼠過量麻醉處死后，完整收集股骨與脛骨，在乙醇中浸泡5 min，轉(zhuǎn)移至超凈臺。用無菌刀片徹底刮除軟組織后，無菌剪刀剪開股骨與脛骨的兩端，用5 mL無菌注射器沖出骨髓，離心獲得細胞沉淀，含rMCSF的培養(yǎng)基(50 ng/mL)重懸成單細胞懸液，種T75培養(yǎng)瓶，2 d后即可獲得大鼠BMDM。本研究采用P2代BMDM完成實驗[13]。

1.2.6RT-qPCR檢測mRNA的表達：按照每孔2×105的密度將BMDM種于六孔板，待長滿底面70 %～80 %時開始藥物干預。完成藥物干預后，去培養(yǎng)基，PBS洗三遍后，每孔加入1 mL TRIZOL，收集于EP管中。完成總RNA的提取，測濃度，按實際用量稀釋后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照說明書的步驟，采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。

1.2.7Western blot檢測蛋白的表達：按照每孔2×105的密度將BMDM種于100 mm的皿中，待細胞貼壁并增殖至鋪滿培養(yǎng)皿底面70 %～80 %時，開始藥物干預，并隔日換液。完成藥物干預后，去培養(yǎng)基，PBS輕輕的沖洗三遍，每皿加入250 μL RIPA裂解液，冰上靜置5 min，后用刮刀刮下貼壁細胞，收集至1.5 mL EP管，離心取上清。按照說明書步驟，測蛋白濃度并完成蛋白表達量的檢測。使用Image J定量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad 7.0完成統(tǒng)計分析及作圖。兩獨立樣本采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間比較存在兩變量時采用雙因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨分化的影響

體外實驗表明，與對照組相比，二甲雙胍抑制RANKL誘導的大鼠BMDMs成熟破骨細胞的形成，并減少破骨細胞的面積，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 二甲雙胍抑制大鼠BMDMs的破骨分化

2.2 二甲雙胍對破骨分化標志基因的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，二甲雙胍(10 μmmol/L)顯著抑制了破骨分化相關標志基因的表達(圖2)，包括：Ctsk、Nfatc1、C-fos、Traf6，差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 二甲雙胍下調(diào)Ctsk、Nfatc1、C-fos、Traf6的表達

2.3 二甲雙胍對破骨分化標志蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，RANKL顯著促進破骨分化標志蛋白的表達，二甲雙胍(10 μmmol/L)顯著抑制了C-FOS，NFATC1，TRAF6，CTSK破骨分化標志物的表達，差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 二甲雙胍抑制C-FOS、NFATC1、TRAF6、CTSK的表達

2.4 二甲雙胍對糖尿病模型鼠體重及空腹血糖的影響

體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，糖尿病模型組空腹血糖顯著升高，體重明顯降低；二甲雙胍灌胃治療后，可以顯著降低糖尿病模型鼠的空腹血糖，并增加大鼠體重，差異均有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 對照組、模型組、治療組的體重、空腹血糖變化曲線

2.5 二甲雙胍對糖尿病模型鼠骨質(zhì)量的影響

病理切片顯示，與對照組相比，模型組骨量下降，骨組織表面的破骨細胞數(shù)量、面積均增加，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，治療組相對骨小梁體積上升，骨組織表面的破骨細胞數(shù)量、面積均減少，差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖5 對照組、模型組、治療組椎體骨組織TRAP染色切片

3 討論

二甲雙胍是一種經(jīng)過臨床驗證的、有效、安全的降糖藥[14]，1957年作為治療糖尿病的藥物被引入。此后，二甲雙胍作為一線口服降糖藥物，無論是單藥治療還是與其他口服降糖藥物和胰島素聯(lián)合治療，在糖尿病的各個階段均推薦使用[15-16]。研究表明對于確診為糖尿病或前驅(qū)糖尿病患者，二甲雙胍能夠穩(wěn)定骨轉(zhuǎn)換標志因子，維持骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡，對骨穩(wěn)態(tài)具有長期的保護作用[17]。數(shù)據(jù)顯示二甲雙胍有益于糖尿病患者血糖的控制及高血糖環(huán)境下的相關疾病，如改善炎癥環(huán)境。炎癥的激活已經(jīng)被認為是破骨分化活躍的主要因素。因此本研究聚焦于探討二甲雙胍對糖尿病模型鼠骨表面破骨細胞形成的抑制作用。

既往研究[18]證實，二甲雙胍可通過阻斷NF-κB信號通路的激活抑制RANKL誘導Raw264.7巨噬細胞破骨分化。鑒于細胞系的局限性，本研究進一步研究了原代骨髓源性巨噬細胞，得出一致的表型。二甲雙胍可以抑制RANKL誘導的BMDM破骨分化，本研究中穩(wěn)定的表型包括減少成熟破骨細胞的數(shù)量和破骨細胞的面積，并下調(diào)破骨分化標志基因的表達，包括：Nfatc1、Ctsk、C-fos、Traf6。這些標志基因可以調(diào)控巨噬細胞分化為破骨細胞前體、破骨細胞前體相互接觸并融合為成熟破骨細胞、成熟的破骨細胞吸收骨基質(zhì)等多個重要的生命過程[19]，這也決定了破骨細胞的數(shù)量和面積以及形成骨陷窩的大小，抑制這些生命過程，直接導致破骨分化受阻，不能形成成熟的破骨細胞。

越來越多的證據(jù)[20-21]表明，糖尿病患者的骨折風險會更高，使用二甲雙胍至少不會增加骨折的風險。在體外實驗陽性結(jié)論的支持下，本研究開展了基于二甲雙胍與糖尿病模型鼠的體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍在降低模型組大鼠空腹血糖、增加體重的同時，可以挽救骨丟失，抑制骨小梁表面的破骨細胞的成熟，減少破骨細胞的數(shù)量和面積。骨組織中成骨細胞的骨形成，與破骨細胞的骨吸收，是同時存在的，并且始終保持動態(tài)變化。當破骨細胞過度活躍，骨吸收能力增強，不可避免的會造成骨質(zhì)量下降。Aurigena等[22]認為，低濃度二甲雙胍[50 mg/(kg·day)]可降低去勢牙周炎大鼠的炎癥反應、氧化應激，由于炎癥反應和氧化應激是巨噬細胞破骨分化的上游刺激因素，因此低濃度的二甲雙胍可以抑制破骨分化，與本研究結(jié)論一致。此外，極低劑量的二甲雙胍[10 mg/(kg·day)]可通過增加成骨細胞分化來防止牙周炎引起的骨丟失。炎癥反應、氧化應激被認為是破骨分化的關鍵上游信號通路，激活炎癥反應、過度的氧化應激反應將會顯著促進破骨分化和骨吸收能力。相反，抑制炎癥環(huán)境的形成，可以減少成熟的破骨細胞數(shù)量。基于這些研究，筆者認為，二甲雙胍能夠降低炎癥因子的釋放水平，阻止炎癥微環(huán)境的形成，促進干細胞的成骨分化，抑制巨噬細胞的破骨分化，促進骨形成，抑制骨吸收，最終達到挽救骨丟失，提高骨質(zhì)量的效果。這也提示二甲雙胍具有雙向調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)的能力，在控制血糖的同時，具有治療長期高血糖引起骨代謝疾病的潛力。

開發(fā)新藥既昂貴又費時。近年來，有學者提出了藥物重新定位(drug repositioning or repurpose)的新概念來尋找和開發(fā)“新藥”，也就是老藥新用[23]。該方法通過闡明新的蛋白功能和靶向分子，將已經(jīng)在臨床推廣使用的藥物用于治療一種新的疾病。這種方法的優(yōu)點顯而易見，如不需要測試毒性或評價藥代動力學[24]。同時，這些優(yōu)點可以帶來更多的益處，如大大減少開發(fā)新藥的成本和時間，提高成功率。

本研究選用治療糖尿病的一線用藥二甲雙胍，治療一種糖尿病繼發(fā)性骨穩(wěn)態(tài)失衡疾病即糖尿病性骨質(zhì)疏松癥，并證實二甲雙胍在體外實驗中能夠抑制BMDM破骨分化，在體內(nèi)實驗中抑制了骨表面破骨細胞的形成，挽救了骨丟失。本研究證實，二甲雙胍在有效控制血糖的同時，可以雙向調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)，為擴大二甲雙胍的適應癥提供研究基礎，為糖尿病性骨質(zhì)疏松癥患者的治療提供更豐富的選擇。