賀焱 杜娟 胡晨琳 楊玲 劉艷群 黃昶荃

1.川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，四川 南充 637000

2.綿陽市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000

3.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶 400016

骨骼系統(tǒng)通過骨重建的方式維持其骨量及生理結構的相對穩(wěn)定，一旦骨重建失衡則易導致骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)。硬化蛋白被認為具有負向調(diào)節(jié)骨重建的作用，在骨質(zhì)疏松的進程中發(fā)揮重要作用。硬化蛋白單克隆抗體(Scl-Ab)的出現(xiàn)在治療骨質(zhì)疏松上向前邁出了一大步，在已經(jīng)完成的幾項大型臨床試驗中證明了羅莫單抗(Romosozumab，ROMO)在目前常用的抗骨質(zhì)疏松藥物中具有更好的作用。ARCH試驗發(fā)現(xiàn)在具有高骨折風險的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性中，ROMO治療12個月繼以阿侖膦酸鈉治療后發(fā)生骨折的風險顯著低于單獨使用阿侖膦酸鈉[1]。FRAME臨床試驗比較了ROMO與特立帕肽對接受雙膦酸鹽治療后的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女骨密度的影響，發(fā)現(xiàn)ROMO能促進髖骨骨密度增加，而在特立帕肽中未觀察到[2]。但由于對硬化蛋白認識不足，硬化蛋白抗體的研究受限，同時對其不良反應還存在擔憂[3-4]，因此硬化蛋白還有深入研究的價值與突破空間，本文將對硬化蛋白及其對骨代謝的作用機制進展作一綜述。

1 硬化蛋白

1.1 硬化蛋白的結構與來源

硬化蛋白是SOST基因表達的一種含190個氨基酸的分泌型糖蛋白[3]，主要在骨骼系統(tǒng)中表達，通過阻斷典型Wnt/β-catenin信號通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)發(fā)揮作用。硬化蛋白是胱氨酸結家族的一個非典型成員，它包含其他家族成員中不存在的長而靈活的N和C末端，剩余的殘基形成3個環(huán)狀結構，環(huán)1和環(huán)3中的殘基形成兩對扭曲的反向平行β鏈并在其尖端通過單個二硫鍵連接，在其凸面存在與其他蛋白質(zhì)的結合位點[5]。環(huán)2具有多種構象，是結合低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)的關鍵區(qū)域[6]。

硬化蛋白主要作用于骨骼系統(tǒng)，骨細胞是其主要來源[7]。之后在其他系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)了Sost mRNA并發(fā)揮生理或病理作用，如促進血管鈣化[8]、調(diào)節(jié)B細胞的發(fā)育和分化[9]等。

1.2 硬化蛋白表達的調(diào)節(jié)

最初，硬化蛋白是在對硬化癥(Sclerosteosis)和范布赫姆病(Van Buchem disease)的研究中發(fā)現(xiàn)的，在這兩種疾病中均發(fā)現(xiàn)SOST基因編碼的硬化蛋白的突變，且都表現(xiàn)為高骨量疾病[10]。硬化癥由SOST基因突變導致，而在范布赫姆病中，在該基因內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)致病突變，但在其染色體17q12上有52kb缺失，影響了SOST基因的轉錄[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn)SOST表達所必需的增強子元件、進化保守區(qū)5(ECR5)以及肌細胞增強因子2(Mef2c)對SOST轉錄活性的調(diào)節(jié)，Mef2c通過與ECR5結合調(diào)節(jié)SOST轉錄[12]。另外，DNA甲基化調(diào)節(jié)SOST的表達，Reppe等[13]在OP中觀察到SOST啟動子甲基化增加，降低了血清硬化蛋白濃度降低并減少了對Wnt信號傳導的抑制，進一步促進骨形成。硬化蛋白對骨代謝的作用備受重視，但對調(diào)節(jié)其表達機制的了解還很少。

2 經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路：硬化蛋白的主要作用通路

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路是硬化蛋白作用的主要通路[3]。當細胞外Wnt配體與跨膜受體(Frizzled)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)形成三元復合物，將導致破壞復合物移位到細胞膜[14]。破壞復合物是軸蛋白(Axin)、酪蛋白激酶1(CK1)、腺瘤性息肉病大腸桿菌(APC)以及糖原合酶激酶3(GSK3)組成的復合物，可以使LRP5/6胞內(nèi)區(qū)域磷酸化，募集軸蛋白(Axin)，破壞破壞復合物的活性，進而導致非磷酸化的β-catenin聚集在細胞質(zhì)中，并轉位到細胞核作為轉錄因子T細胞因子(Tcf)和淋巴因子結合因子(LEF)的激活因子發(fā)揮作用，啟動Wnt靶基因的轉錄[15]。在硬化蛋白抑制狀態(tài)下，硬化蛋白與LRP5/6細胞表面受體結合，阻止Wnt配體與LRP5/6相互作用，將抑制典型的Wnt信號轉導。細胞質(zhì)中的β-catenin被磷酸化并被破壞復合物靶向泛素化，在蛋白酶體中被降解[14]。

硬化蛋白還可以通過非經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用。在軟骨細胞中，Wnt3a可激活c-JunN末端激酶(JNK)和PKC，用硬化蛋白處理僅抑制磷酸化JNK，表明硬化蛋白可通過非經(jīng)典c-JunN末端激酶(JNK)信號通路發(fā)揮作用[16]。針對不同Wnt配體，硬化蛋白可能還存在其特有通路。

在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號中，LRP5/6與低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP4)發(fā)揮著重要作用，對Wnt信號轉導必不可少。LRP5和LRP6具有高度同源性并在機體組織中廣泛表達，它們在介導Wnt信號傳導方面具有相似的功能。LRP4與LRP5/6結構相似，但在硬化蛋白中發(fā)揮著不同的作用。

2.1 LRP5/LRP6

LRP5和LRP6為單程跨膜蛋白，存在于細胞表面，其胞外區(qū)由4個重復單元(從N到C末端命名為E1到E4)組成，每個重復單元都有一個YWTDLDL-螺旋域和一個表皮生長因子樣域。Bourhis等[17]研究發(fā)現(xiàn) E1結合硬化蛋白中的短肽，因此LRP5/6 E1可作為藥物研制的靶點。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)硬化蛋白的C端與LRP6 E2之間存在結合位點，并能增加SOST與LRP6親和力，但其作用不如SOST環(huán)2-LRP6 E1廣泛。因此針對環(huán)2和C端肽的抗體治療效果可能更好、不良反應更少，是藥物研發(fā)的另一種選擇。Sebastian等[19]通過測序技術來鑒定成骨細胞中受Wnt3a調(diào)控的靶基因，發(fā)現(xiàn)與LRP6相比，LRP5的缺失對Wnt3a信號傳導的影響很小。Choi等[20]通過使用含有喹喔啉的BMD4503-2與LRP5/6-硬化蛋白復合物的競爭性結合，恢復了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的下調(diào)活性。因此，未來可基于結構設計開發(fā)針對LRP5/6-硬化蛋白相互作用的小分子抑制劑。

2.2 LRP4

最初研究發(fā)現(xiàn)，LRP4的第3個螺旋槳結構域(E3)中發(fā)生了兩個產(chǎn)生類硬化癥的人類錯義突變[21]，因此提出LRP4可能促進硬化蛋白對Wnt信號的抑制作用。Fijalkowski等[22]在因LRP4突變而患有硬化癥的患者中發(fā)現(xiàn)血清硬化蛋白水平升高，因此推測硬化蛋白分泌后在LRP4的作用下保留在骨骼中發(fā)揮作用。Bullock等[21]進一步研究發(fā)現(xiàn)攜帶LRP4-R1170W錯義突變的小鼠產(chǎn)生高骨量表型，并且對硬化蛋白水平的改變不太敏感。LRP4可作為藥物研究的靶點，其與硬化蛋白作用的具體機制有待進一步研究。

3 硬化蛋白在骨骼系統(tǒng)中的作用

3.1 破骨細胞

已知RANKL/OPG比值是破骨細胞形成的關鍵因素并影響其活性，硬化蛋白可通過影響RANKL間接促進骨吸收[23]。而缺乏β-catenin的成骨細胞表現(xiàn)出成熟和礦化受損、RANKL表達增加及OPG表達減弱[3]。一直認為破骨細胞不表達Wnt受體，硬化蛋白通過作用于成骨細胞Wnt通路影響RANKL進一步作用于破骨細胞，但相關實驗未能排除其他通路對β-catenin的影響，并且目前所有研究均未表明成骨細胞Wnt通路如何影響RANKL。Weivoda等[24]進一步發(fā)現(xiàn)破骨細胞可表達經(jīng)典的Wnt受體，Wnt3a直接通過破骨細胞前體中的經(jīng)典(β-catenin)和非經(jīng)典(cAMP/PKA)途徑抑制破骨細胞分化。

3.2 成骨細胞

成骨細胞起源于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)，在Wnt/β-catenin信號和轉錄因子(如Runx2和Osterix)的特異性激活下，骨祖細胞向成骨細胞方向分化[3]，產(chǎn)生并礦化骨基質(zhì)，部分成骨細胞作為骨細胞嵌入鈣化基質(zhì)中。硬化蛋白作為骨形成抑制劑的作用貫穿于成骨細胞譜系：抑制骨祖細胞的增殖，影響成骨前體細胞的增殖和募集，抑制成骨細胞的成熟和分化，負調(diào)控成骨細胞的活性。在老年卵巢切除大鼠中發(fā)現(xiàn)Scl-Ab可以促進骨祖細胞增殖并減少凋亡[25]，Scl-Ab還能增加成骨細胞前體的數(shù)量并促進其分化為成熟成骨細胞[26]，同時增加I型前膠原氨基末端前肽(P1NP)、骨特異性堿性磷酸酶(BSAP)和骨鈣素等骨形成標記物[27]。另外，Thouverey等[28]發(fā)現(xiàn)硬化蛋白還可以通過激活血小板衍生生長因子受體(PDGFR)及其下游信號通路抑制成骨細胞分化。在人類成骨細胞中，硬化蛋白通過激活caspase1、3、4和7以及增加促凋亡因子bax的表達來誘導細胞凋亡[3]。

硬化蛋白還具有維持骨襯里細胞(bone lining cell，BLC)靜止狀態(tài)的作用，骨襯里細胞相當于成骨細胞儲備池，使用Scl-Ab治療后，小鼠BLC在骨膜和皮質(zhì)內(nèi)表面迅速轉變?yōu)榛钴S的成骨細胞[29]。但是目前對于骨襯里細胞的研究還比較少，關于其作用機制還有待進一步研究，或許可為促進成骨作用提供新途徑。

3.3 骨髓脂肪組織

與成骨細胞一樣，骨髓脂肪組織(BMAT)也起源于BMMSC，因此 BMMSC分化為成骨細胞與脂肪細胞之間存在競爭性。SOST可通過抑制前脂肪細胞中的Wnt信號誘導脂肪生成[30]，而Scl-Ab可以恢復在去卵巢兔的骨髓脂肪擴張[31]。另外，Abdallah等[32]發(fā)現(xiàn)骨髓脂肪細胞可以通過脂肪因子誘導NF-κB途徑激活的機制阻斷BMPs信號傳導，從而對BMMSC的成骨細胞分化發(fā)揮抑制作用，但目前沒有證據(jù)證明硬化蛋白對此過程有無影響。骨髓脂肪細胞對骨代謝的影響備受關注，但至今無重大進展，硬化蛋白可能是潛在突破點。

3.4 調(diào)節(jié)骨結構、骨量與骨強度

硬化蛋白是骨形成、骨量和骨強度的負向調(diào)節(jié)劑，Scl-Ab可拮抗這種作用，Scl-Ab還可以使骨折愈合過程中骨痂質(zhì)量與強度增加[30]。硬化蛋白還可以影響骨骼微結構，Scl-Ab可以消除卵巢切除術導致的皮質(zhì)骨中骨細胞形態(tài)和結構異常[33]以及改善雄性食蟹猴骨小梁微結構[34]。Albiol等[35]研究發(fā)現(xiàn)硬化蛋白缺乏癥導致雄性和雌性小鼠的小梁骨形成增加，但僅導致雌性的小梁骨吸收減少，關于硬化蛋白對骨骼作用的性別差異還在進一步研究中。

4 硬化蛋白單克隆抗體

硬化蛋白單克隆抗體是目前唯一一個兼具促進骨形成與抑制骨吸收雙重作用的骨質(zhì)疏松治療藥物。如前所述，許多動物以及臨床試驗[10,36]均表明Scl-Ab治療可增加骨形成并降低骨吸收。但也存在許多問題，硬化蛋白抗體的作用呈現(xiàn)出時間依賴性，并且在不同骨組織衰減時間存在差異[37-38]，但其機制還不明確。另外，反復使用硬化蛋白抗體，骨形成反應的減弱可能與Wnt拮抗劑(Dkk1、SFRP4、Bglap、Postn和WISP1)的上調(diào)有關[39]。關于ROMO臨床試驗中發(fā)現(xiàn)的不良事件，特別是ROMO使用者的心血管風險[40]，是目前最令人擔憂的問題，一項關于Romosozumab隨機臨床試驗的薈萃分析表明，Romosozumab 的心血管事件風險可能更高[41]，因此針對硬化蛋白抗體的研發(fā)還有很大潛力與發(fā)展空間。

5 小結與展望

一直以來，抗骨吸收藥物占據(jù)抗骨質(zhì)疏松藥物的主要市場，研發(fā)促進骨形成的藥物是一大趨勢。目前硬化蛋白對骨骼系統(tǒng)的作用機制研究已取得重大進展，但由于其不良反應，臨床應用受到限制，因此，目前在著力于開發(fā)新型促骨形成藥物的同時，優(yōu)化硬化蛋白抗體，研制出不良反應更小，療效更佳的硬化蛋白抗體也是有潛力的方向。硬化蛋白對成骨細胞與破骨細胞的作用研究已經(jīng)比較成熟，但關于硬化蛋白的體內(nèi)調(diào)節(jié)機制以及其對骨髓脂肪細胞的作用機制研究還存在突破空間。另外，為進一步明確硬化蛋白抗體的不良反應，能更好地指導ROMO的臨床應用，硬化蛋白對骨骼外系統(tǒng)的作用以及機制仍需深入研究。