李娜 盧雪玲 娜迪拉

新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830000

骨形態(tài)蛋白(bone morphoprotein，BMPs)是多功能生長(zhǎng)因子，它屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族，已有近20種BMPs成員被發(fā)現(xiàn)，它們具有不同程度促進(jìn)成骨干細(xì)胞分化的能力，成骨干細(xì)胞分化是骨組織損傷修復(fù)與再生過(guò)程的生理基礎(chǔ)。因此如何精準(zhǔn)、高效地調(diào)控骨干細(xì)胞的定向分化，實(shí)現(xiàn)人骨組織的修復(fù)與再生，是目前基礎(chǔ)研究和臨床研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題。本文將通過(guò)對(duì)骨形態(tài)蛋白-2、骨形態(tài)蛋白-4、骨形態(tài)蛋白-6、骨形態(tài)蛋白-7、骨形態(tài)蛋白-9在促進(jìn)骨再生的臨床研究進(jìn)展上分別進(jìn)行闡述。

1 骨形態(tài)蛋白-2的臨床研究進(jìn)展

骨形態(tài)蛋白-2(bone morphoprotein-2，BMP-2)是第一個(gè)被描述的BMPs，BMP-2的一些特定功能包括手指形成和激活成骨基因。由于其多樣化的功能和成骨潛力，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)重組人BMP-2 (rhBMP-2)用于脊柱融合手術(shù)、脛骨干修復(fù)和上頜竇重建手術(shù)。然而，在首次注射rhBMP-2后不久，就出現(xiàn)了一些不良并發(fā)癥，血腫形成，骨溶解、增加自發(fā)性骨折、冠狀動(dòng)脈疾病、近視和其他并發(fā)癥[1]。這是由于BMP-2在初始暴發(fā)釋放，導(dǎo)致組織過(guò)度腫脹，再加上骨重塑階段的生理性炎癥期。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，已有報(bào)道使用海藻酸鹽、殼聚糖[2]、膠原[3]、納米顆粒[4]、阿侖膦酸鹽和肝素[5]對(duì)雙相磷酸鈣(biphasic calcium phosphate，BCP)進(jìn)行表面改性，以防止初始爆發(fā)釋放，并允許BMP-2的長(zhǎng)時(shí)間釋放，但很少有研究實(shí)現(xiàn)了在一定時(shí)期內(nèi)阻斷釋放。因此，有必要制作一種理想的骨基質(zhì)，能夠克服BMP-2傳遞的局限性，研究人員假設(shè)了BCP上的涂層多層膜通過(guò)減少BMP-2的初始釋放，并在骨重建過(guò)程中維持BMP-2的釋放，這些策略是將BCP和BMP-2之間的高親和力對(duì)釋放的抑制降到最低，并以能夠與BMP-2結(jié)合的替代物修飾BCP表面[3]，以期能制備的BCP通過(guò)多層膜程序化釋放BMP-2[6]。

2 骨形態(tài)蛋白-4的臨床研究進(jìn)展

骨形態(tài)蛋白-4(bone morphoprotein-4，BMP-4)作為已知的可促進(jìn)骨生成的生長(zhǎng)因子，也可以作為抗骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)，BMP-4在促進(jìn)骨再生能力比BMP-2更弱一些[7]。為了克服這些障礙，研究人員通過(guò)藥物調(diào)控BMP-4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程促進(jìn)成骨作用[8]，中醫(yī)學(xué)主張“腎藏精主骨生髓”[9]，許多中藥都具有促進(jìn)成骨的功效。小檗堿可以通過(guò)增強(qiáng)BMP-4誘導(dǎo)的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和ALP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但是低效力和低生物利用度限制了該藥物的臨床開發(fā)。Han等[10]先前合成了一種化合物Q8，該化合物是小檗堿的結(jié)構(gòu)同系物，同時(shí)，Q8也可以抑制了PPARγ(PPARγ是一種已知的骨形成負(fù)調(diào)控因子)的表達(dá)和活性，進(jìn)而增加了核中β-catenin的表達(dá)，并最終促進(jìn)了成骨細(xì)胞分化。還有一些例如淫羊藿苷[11]、杜仲[12]等，都具有促進(jìn)成骨的功效。Shiozaki等[13]研究將BMP-4與纖維連接蛋白衍生的納米載體——膠原結(jié)合域(collagen-binding domain，CBD)融合。檢測(cè)了CBD-BMP-4融合蛋白的穩(wěn)定性及成骨能力，并分別對(duì)照了是否使用海綿支架。結(jié)果表明納米載體-CBD增強(qiáng)了BMP-4在骨中的保留，結(jié)果表明在缺乏支架的情況，CBD-BMP-4誘導(dǎo)的骨形成比單獨(dú)BMP-4、單獨(dú)CBD更好。

此外，除了促進(jìn)骨再生，BMP-4還具有調(diào)節(jié)全身胰島素敏感性和肝糖脂代謝、脂肪細(xì)胞褐變和全身能量平衡方面具有治療潛力。且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明長(zhǎng)期使用BMP4治療沒有重大不良反應(yīng)的報(bào)道。BMP-4在調(diào)節(jié)全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗方面發(fā)揮重要作用，它對(duì)肝糖的產(chǎn)生和脂質(zhì)代謝也有重要的抑制作用[14]，因此BMP-4靶向治療可能對(duì)于糖尿病相關(guān)的代謝性骨病人群更為有益。Krouwels等[15]通過(guò)動(dòng)物研究比較了BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7及他們的組合和異二聚體對(duì)人髓核(nucleus pulposus，NP)細(xì)胞的再生作用，認(rèn)為BMP-4對(duì)于椎間盤再生潛力更為突出。

3 骨形態(tài)蛋白-6的臨床研究進(jìn)展

BMPs已顯示出增強(qiáng)間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells，MCs)的成骨分化并促進(jìn)骨形成。已知骨形態(tài)蛋白-6(bone morphoprotein-6，BMP-6)憑借其骨誘導(dǎo)和細(xì)胞類型特異性增殖活性，在MCs向成骨分化的過(guò)程中起重要作用。然而，與BMP-6骨誘導(dǎo)活性有關(guān)的分子機(jī)制仍不清楚，并且仍需進(jìn)一步研究。Msx2是轉(zhuǎn)錄因子同源框基因家族的成員，促進(jìn)鈣化。因此，為了知道它是否也可能在BMP-6誘導(dǎo)的成骨中發(fā)揮作用，研究人員用BMP-6、腺病毒-msx2 (Ad-Msx2)或腺病毒-simsx2 (Ad-siMsx2)處理兩種小鼠間充質(zhì)細(xì)胞系，mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果表明BMP-6可以增強(qiáng)Msx2的表達(dá)并激活Smad 1/5/8、p38和ERK1/2的磷酸化。被Ad-Msx2轉(zhuǎn)染后，顯著促進(jìn)了BMP-6誘導(dǎo)的磷酸化激活。轉(zhuǎn)染Ad-Msx2后，Mesenchymal cells誘導(dǎo)的磷酸化激活明顯增強(qiáng)。相反，被 Ad-siMsx2轉(zhuǎn)染的兩個(gè)細(xì)胞系即使在被BMP-6誘導(dǎo)后也呈現(xiàn)出三種磷酸化蛋白的抑制表達(dá)[16]。這些發(fā)現(xiàn)為理解BMP-6誘導(dǎo)成骨機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)，并為骨缺損的治療提供了靶點(diǎn)。

有先前的體外研究表明，在保留生物活性的前提下，BMP-6釋放時(shí)間可達(dá)30 d。因此BMP-6的持續(xù)釋放對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的成骨分化具有較好的作用，生物分子載體結(jié)構(gòu)由于其在骨組織工程領(lǐng)域的潛在應(yīng)用而引起廣泛關(guān)注，Toprak等[17]開發(fā)了用于控制BMP-6的受控釋放的MOF嵌入式電紡纖維支架，結(jié)果證明電紡支架中嵌入mof載體可作為骨組織工程應(yīng)用中骨再生的有效平臺(tái)。

此外，BMP-6對(duì)維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，Pauk等[18]用BMP-6治療小鼠6 d，然后對(duì)其胰島素釋放、體重、脂質(zhì)指標(biāo)和糖耐量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)循環(huán)血糖和血脂水平降低，隨后血漿胰島素水平顯著升高，呈劑量依賴性。此外，在糖耐量試驗(yàn)中，BMP-6改善了葡萄糖波動(dòng)，降低了21%的總血糖反應(yīng)。在大鼠肝癌細(xì)胞中，BMP-6通過(guò)下調(diào)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PepCK)表達(dá)抑制而糖異生和葡萄糖輸出。Guo等[19]通過(guò)檢測(cè)骨痂和骨中BMP-6的數(shù)量來(lái)評(píng)估股骨骨折愈合情況，發(fā)現(xiàn)非糖尿病和糖尿病動(dòng)物骨痂和骨折骨中BMP-6的表達(dá)顯著升高。然而，與非糖尿病對(duì)照組相比，糖尿病動(dòng)物BMP-6水平顯著降低，鈣化骨痂較小，愈合骨的承載能力較差，證實(shí)了糖尿病動(dòng)物骨折延遲愈合可能與BMP-6缺乏有關(guān)。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)從1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)。供體中分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone derived mesenchystem cells，BMSCs)比非T1DM供體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨的能力更低，加入外源性BMP-6培養(yǎng)后，T1DM供體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨得以恢復(fù)，而BMP-6治療似乎并不影響非T1DM對(duì)照細(xì)胞。在腹腔注射BMP-6減輕了糖尿病小鼠的骨丟失，增加了骨密度(bone mineral density，BMD)。故BMP6可能對(duì)于T1DM的骨再生有著更為突出的作用。

4 骨形態(tài)蛋白-7的臨床研究進(jìn)展

骨形態(tài)蛋白-7(bone morphoprotein-7，BMP-7)和BMP-6的氨基酸序列有87%相似的同源物，是一種存在于血液中的細(xì)胞因子。BMP-7也可以促進(jìn)2型糖尿病小鼠的胰島素分泌和改善其胰島素敏感性，從而降低血糖[21]。除了上述提到的可降解生物及金屬支架，Mantripragada等[22]制備了可注射的殼聚糖微粒子，該方法通過(guò)去除油脂或有毒化學(xué)物質(zhì)，并利用低溫和壓力穩(wěn)定生長(zhǎng)因子。將200 ng BMP-7通過(guò)封裝和涂層兩種方法加入到殼聚糖微粒子中，這些微粒在體內(nèi)測(cè)試，確定6周和12周大鼠股骨骨缺損的生物學(xué)反應(yīng)，組織學(xué)顯示6周時(shí)微顆粒周圍有輕微炎癥反應(yīng)，12周時(shí)炎癥反應(yīng)減少，Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)，含微顆粒組的骨表面密度和孔隙率顯著更高，這表明在微顆粒存在下形成的新骨具有更強(qiáng)的互連性和多孔性，光子顯微鏡進(jìn)行的膠原原纖維分析顯示，含微粒子組的膠原束的形成顯著改善。Chen等[23]的研究表明，腺病毒介導(dǎo)的BMP-7表達(dá)促進(jìn)了人成纖維細(xì)胞的成骨分化并增強(qiáng)了體外成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。在注射人成纖維細(xì)胞-水凝膠混合物后，感染BMP-7腺病毒的細(xì)胞在體內(nèi)顯示出增強(qiáng)的骨形成和成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。上述研究表明BMP-7顯著促進(jìn)人成纖維細(xì)胞成骨，并證實(shí)用表達(dá)BMP-7的腺病毒感染人成纖維細(xì)胞是骨組織工程的有用工具。

另外，Yuan等[24]檢測(cè)到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和強(qiáng)直性脊椎炎(AS)患者血清BMP-7和HO-1水平升高。此外，RA和AS患者血清HO-1、BMP-7和Runx2水平與其他常見骨標(biāo)志物顯著相關(guān)，但與疾病活動(dòng)性評(píng)分無(wú)相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)HO-1和BMP-7有很高的潛力參與RA和AS致病骨代謝的基本病理過(guò)程。因此，BMP-7可能對(duì)炎癥性骨關(guān)節(jié)病的潛在治療應(yīng)用可進(jìn)一步研究。

5 骨形態(tài)蛋白-9的臨床研究進(jìn)展

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9，BMP-9)一種由肝臟產(chǎn)生和分泌的生物分子[25]，存在于血液循環(huán)中，具有抗肝纖維化[26]、抗腫瘤、抗心力衰竭和抗糖尿病等多種作用。BMP-9同時(shí)能明顯誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化，這種活性明顯強(qiáng)于已用于臨床的BMP-2和BMP-7,是目前已發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化能力最強(qiáng)的因子之一[27]。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了BMP-9可以與多條關(guān)鍵信號(hào)通路(如BMP-9-SMAD、BMP9-MAPK、BMP9-TGFIB、BMP9-Wnt/B-catenin與BMP-9-Notch信號(hào)通路)共同發(fā)揮調(diào)控作用[28]。Zhou等[29]的研究中發(fā)現(xiàn)BMP-9通過(guò)上調(diào)LGR6和激活Wnt/beta-catenin通路而促進(jìn)骨形成，還通過(guò)抑制Akt-NF-kappa B- nfatc1通路抑制NF-kappa B受體激活體配體(RANKL)誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化而抑制骨吸收，從而提高了去卵巢小鼠的骨密度，恢復(fù)了骨微結(jié)構(gòu)，改善了骨生化特性。BMP-9作為一種新型骨形成和骨吸收雙重調(diào)節(jié)劑在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的潛在治療應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

哺乳動(dòng)物的再生能力較差，對(duì)創(chuàng)傷性損傷的典型反應(yīng)是纖維化愈合[30]，使用發(fā)育因子在非再生截肢傷口重新啟動(dòng)形態(tài)發(fā)生是增強(qiáng)哺乳動(dòng)物再生反應(yīng)的一種策略[31]。在關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中，滑膜腔的形成是關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)生的中心，而缺乏BMP-2拮抗劑Noggin11的手指滑膜腔的形成失敗，提示調(diào)節(jié)BMPs信號(hào)是關(guān)節(jié)形態(tài)發(fā)生的必要條件。BMP-2能夠誘導(dǎo)殘端骨，但不能再生關(guān)節(jié)及遠(yuǎn)端骨[32]。Yu等[33]的研究發(fā)現(xiàn)BMP-9誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)再生需要蛋白多糖4(Prg4)基因，BMP-2和BMP-9的連續(xù)治療可以刺激骨和關(guān)節(jié)細(xì)胞的再生，否則將經(jīng)歷纖維化愈合。因此Prg4基因有望成為誘導(dǎo)BMP-9刺激骨及骨關(guān)節(jié)再生的基因治療靶點(diǎn)。

6 小結(jié)與展望

在臨床上，外源性所致的骨缺損以及骨骼動(dòng)態(tài)平衡改變?yōu)樘卣鞯亩喾N疾病導(dǎo)致的代謝性骨疾病較為常見，因此更加精準(zhǔn)、高效的定向調(diào)控骨干細(xì)胞的分化成為當(dāng)下需要解決的難題。骨形態(tài)蛋白具有骨組織的修復(fù)與再生功能，目前研究較多的BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9在刺激骨干細(xì)胞分化的機(jī)制上非常復(fù)雜，在臨床的應(yīng)用上也面臨著很多的挑戰(zhàn)，BMP2在體內(nèi)存活時(shí)間短，且具有初始暴發(fā)性釋放的特點(diǎn)，因此如何穩(wěn)定持續(xù)釋放是其要解決的難題，BMP-4在促進(jìn)骨再生能力比BMP-2更弱一些，例如小檗堿、杜仲、淫羊藿苷及穩(wěn)定支架的應(yīng)用成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)，此外BMP-4具有調(diào)節(jié)全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗的作用。BMP-6、BMP-7為相似同源物，它們對(duì)維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，因此在代謝性骨病的治療中有潛在價(jià)值。BMP-9被目前已發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化能力最強(qiáng)的因子之一，具有雙重調(diào)節(jié)作用，且在骨關(guān)節(jié)及遠(yuǎn)端骨的再生上具有獨(dú)特作用。