王劍 李屹 王實 劉永林 劉秀 豐雪妮 馬越嬌 郭婧潭 劉劍輝 劉文艷 張景云 馬金 宋光熠 鄭洪新

1. 遼寧醫(yī)藥職業(yè)學院，遼寧 沈陽 110101

2. 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)為原發(fā)性Ⅰ型骨質疏松癥，由于婦女絕經后雌激素缺乏誘導骨質流失、骨組織微結構損壞、骨變脆、骨折風險增加[1]。隨著我國步入老齡化社會，其危害日益嚴重[2]。PMOP屬中醫(yī)“骨痿”范疇，主要由于絕經后婦女腎精不足、生髓乏源、骨失滋養(yǎng)所致[2]。金剛丸(金·劉完素《素問病機氣宜保命集》)的功能為填精補腎、強筋壯骨，主腎損骨痿，可提高骨礦含量和雌激素水平，有效治療PMOP[3-4]，但關于其作用機制的研究頗少。近年來，細胞生命活動的重要調節(jié)器-Hippo信號通路調節(jié)骨代謝的機制研究成為熱點[5-6]，通路核心基因Mst2缺乏的小鼠表現出骨質疏松癥表型[7]，核心分子TAZ是成骨細胞分化的重要分子標志[8]，二者有望成為防治骨質疏松癥新的有效靶點。因此，本研究基于Hippo信號通路核心基因mRNA表達，探索金剛丸防治PMOP的作用機制，為PMOP的中醫(yī)藥防治提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級Wistar雌性大鼠108只，3月齡，體重(220±20)g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001，飼養(yǎng)于環(huán)境室溫20 ℃～25 ℃、濕度40 %～60 %，自由飲水、進食(大、小鼠維持飼料，購于遼寧長生生物技術股份有限公司)。

1.1.2實驗藥品：金剛丸(成份：肉蓯蓉、豬腰子、綿萆薢、菟絲子、炒杜仲，“益銘博大”陜西天洋制藥有限責任公司，國藥準字Z61020726)；仙靈骨葆膠囊(成份：淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補骨脂、地黃，國藥集團同濟堂[貴州]制藥有限公司，國藥準字Z20025337)；骨化三醇膠丸((5Z,7E)-9,10-開環(huán)膽甾-5,7,10(19)-三烯-1α,3β,25-三醇，“羅蓋全”Roche Pharma(Schweiz)AG，進口藥品注冊證號：H20140598;H20140597，上海羅氏制藥有限公司分裝，國藥準字J20150011)。

1.1.3主要儀器：STRATOS DR X射線骨密度測定儀(Diagnostic Medical System SA，法國)、石蠟切片機(萊卡，德國)、BX51顯微鏡(OLYMPUS，日本)、ELx800酶標儀(Biotek，美國)、Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀(安捷倫，德國)、BioDrop Duo核酸蛋白分析儀(BioDrop，英國)。

1.1.4主要試劑：蘇木素染色液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1180-1)、伊紅染色液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1180-2)、大鼠堿性磷酸酶(ALP)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(AMEKO，貨號：AE91640Ra)、總RNA提取試劑盒(柱式法，Takara，貨號：9767)、反轉錄試劑盒(Takara，貨號：RR047A)、定量PCR試劑盒(嵌合熒光法，Takara，貨號：RR820A)。

1.2 方法

1.2.1分組與造模：適應性喂養(yǎng)大鼠3 d后，完全隨機分出正常組與假手術組,各12只，余者造模。除正常組外，均采取腹腔注射戊巴比妥鈉方式麻醉(2 %，35 mg/kg)。將大鼠麻醉后，除假手術組外，均采取腹部切口摘除雙側卵巢建立PMOP大鼠模型[9]，假手術組只行腹部切口而不摘除卵巢，局部涂適量青霉素預防感染。術后，造模大鼠死亡1只，存活83只。完全隨機分為模型組13只，金剛丸高、中、低劑量組、仙靈骨葆對照組、骨化三醇對照組各14只。

1.2.2給藥：術后7 d開始灌胃給藥，1次/d(每灌6 d間歇1 d)，連續(xù)12周。給藥劑量：大鼠等效劑量為成人(成人體質量按60 kg，成人每日用藥劑量依據臨床用藥的藥品說明書)的6.3倍。金剛丸高劑量組(大鼠等效劑量的2倍)：3.78 g/kg體質量；金剛丸中劑量組(大鼠等效劑量)：1.89 g/kg體質量；金剛丸低劑量組(大鼠等效劑量的1/2)：0.945 g/kg體質量；仙靈骨葆對照組(大鼠等效劑量)：0.315 g/kg體質量；骨化三醇對照組(大鼠等效劑量)：0.052 5 μg/kg體質量。給藥容積：金剛丸高劑量組：1.5 mL/100 g體質量；其余各組：1 mL/100 g體質量。正常組、假手術組、模型組：給予等體積生理鹽水。灌胃藥液制備：金剛丸為小粒水蜜丸，以蒸餾水冷藏泡軟后，在研缽內研碎，制成混懸藥液；仙靈骨葆以蒸餾水分散膠囊內藥粉，制成混懸藥液；骨化三醇以蒸餾水冷藏泡軟膠丸后，剪破囊壁，其內油狀液流出，加少量淀粉，灌胃器反復抽推吸打，助其分散于蒸餾水中。

1.2.3取材：末次灌胃后，禁食24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(2 %，35 mg/kg)，頸動脈取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，待測ALP；每組左后肢前10號取股骨頭，先經液氮速凍，再放置-80 ℃冰箱凍存，待做實時定量RT-PCR；余者取全股骨，用10 %甲醛溶液固定，待做石蠟切片；每組右后肢全部取全股骨(骨化三醇對照組2只股骨未取完整，不用于指標檢測)，置于-20 ℃冰箱凍存，待測骨密度。

1.2.4指標檢測

1.2.4.1骨密度：用X射線骨密度測定儀檢測離體股骨骨密度，精細模式掃描，用儀器附帶的小動物軟件(版本：V4.0.7.1)分析，結果示值為單位面積骨礦含量(g/cm2)。

1.2.4.2骨顯微形態(tài)結構：通過10 %硝酸脫鈣法制作股骨頭石蠟切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察(200倍)并拍照。

1.2.4.3血清ALP：采用ELISA法按照試劑盒說明書進行血清ALP檢測。準備試劑、樣品和標準品，加樣，洗板，顯色，終止，以空白孔調零，于450 nm波長處讀各孔OD值，計算樣品ALP濃度。

1.2.4.4骨組織Mst2、Lats1、Taz mRNA表達：按照總RNA提取(柱式法)和反轉錄試劑盒說明書進行總RNA提取(使用核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度，分光光度法測波長260 nm與280 nm的OD值，計算OD260/OD280，約在2.0左右，提示為RNA純品。)和反轉錄，使用熒光定量PCR儀，按照定量PCR試劑盒(嵌合熒光法)說明書進行QPCR。使用Primer-BLAST設計引物，引物序列見表1。以β-actin進行校準，以各樣品Ct值計算樣品各目標基因的mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 離體股骨骨密度

與正常組比較，模型組離體股骨骨密度顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，除金剛丸低劑量組[離體股骨骨密度有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)]外，各給藥組離體股骨骨密度均顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠離體股骨骨密度

2.2 股骨頭顯微形態(tài)結構

與正常組比較，模型組股骨頭密質骨板變薄、多孔、孔大，松質骨小梁變細、斷裂、破壞，骨髓腔顯著擴大，骨微結構顯著破壞；與模型組比較，各給藥組以上骨微結構病變、破壞均得以改善，以金剛丸高、中劑量組改善最顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨頭顯微形態(tài)結構(200倍)

2.3 血清ALP

與正常組比較，模型組血清ALP顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組血清ALP均顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清

2.4 骨組織Mst2、Lats1、Taz mRNA表達

與正常組比較，模型組骨組織Mst2、Lats1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)，Taz mRNA表達顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組骨組織Mst2、Lats1 mRNA表達均顯著降低(P<0.01)，Taz mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。見表4。

表4 各組骨組織Mst2、Lats1、Taz mRNA表達

3 討論

絕經后骨質疏松癥屬中醫(yī)“骨痿”范疇，主要由于絕經后婦女腎精不足、生髓乏源、骨失滋養(yǎng)所致，是一種與增齡相關的疾病[2]，防治應采用補腎填精壯骨法。

金·劉完素《素問病機氣宜保命集》卷下記載“金剛丸”(萆薢、杜仲[炒去絲]、蓯蓉[酒浸]、菟絲子[酒浸]各等分，上藥為細末，酒煮豬腰子為丸)，功能填精補腎、強筋壯骨，主腎損骨痿，不能起于床。明·樓英《醫(yī)學綱目》和明·王肯堂《證治準繩·類方》中亦有相關記載。近年研究表明，金剛丸可提高骨礦含量和雌激素水平，通過雙向調節(jié)PMOP骨形成與骨吸收的代謝失衡而起到治療作用[3-4]。中醫(yī)古籍和現代文獻均表明金剛丸可有效治療PMOP，但關于其作用機制的研究頗少。本研究深入探索了金剛丸防治PMOP的作用機制，為其臨床推廣應用、進一步闡明補腎填精法防治PMOP的作用機制提供了科學的實驗依據，具有重大意義。

近年，首次在果蠅體內發(fā)現、進化上高度保守[10]的細胞生命活動重要調節(jié)器-Hippo信號通路調控骨代謝的機制研究頗受關注[5-6]。哺乳動物的經典Hippo信號通路核心成員包括[11]：哺乳動物sterile 20樣激酶(mammalian sterile 20-like protein kinase,MST)1/2及其支架蛋白SAV1、大腫瘤抑制因子(Large tumor suppressor homologue,LATS)1/2及其支架蛋白MOB1、Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)/具有PDZ結合域的轉錄共激活因子(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ)，MST1/2激酶磷酸化激活，與SAV1形成復合體，從而磷酸化結合MOB1的LATS1/2激酶，進而磷酸化YAP/TAZ，結合細胞質中的14-3-3 蛋白而滯留在胞質中，泛素化后被蛋白酶降解[12-13]。如果Hippo信號通路被抑制，未磷酸化的YAP/TAZ則可進入細胞核，結合其他轉錄因子，共同促進靶基因轉錄[14]。

研究[15-17]表明，Hippo信號通路的TAZ結合成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2，共促進下游成骨靶基因轉錄，促進骨髓間充質干細胞成骨分化；該通路亦可通過介導Wnt信號通路而調控成骨細胞的增殖和分化[18-19]。TAZ是成骨細胞分化重要的分子標記，給予骨質疏松癥模型動物口服TAZ調制劑TM-25659，可減少骨量丟失，提高骨密度[8]。Mst2是調節(jié)成骨細胞與破骨細胞二者功能平衡的重要基因，缺乏Mst2基因的小鼠有骨質疏松表型表現[7]。因此，Hippo信號通路對骨質疏松癥的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用，Mst2、Taz有望成為防治骨質疏松癥新的有效靶點，但目前中醫(yī)治法及相應復方通過調控該信號通路進而防治PMOP的機理研究尚未見到文獻報道。

本研究中的模型組骨密度顯著降低、骨微結構顯著破壞、骨形成標志物血清ALP顯著降低，驗證了PMOP大鼠模型復制成功。摘除雙側卵巢導致PMOP模型大鼠骨組織Hippo信號通路Mst2、Lats1轉錄上調，可能導致MST2、LATS1翻譯、磷酸化加快，級聯(lián)磷酸化TAZ而使其滯留在胞質中被降解；通路Taz轉錄下調，可能導致TAZ翻譯減慢，均可使TAZ入核減慢，而抑制其結合核內成骨分化關鍵轉錄因子RUNX2共同促進下游成骨靶基因(如堿性磷酸酶、骨鈣素等)轉錄的功能，抑制成骨細胞分化和成骨，從而導致骨質疏松。具有填精補腎、強筋壯骨功效的中、高劑量金剛丸均使PMOP模型大鼠離體股骨骨密度顯著升高、骨微結構顯著改善、骨形成標志物血清ALP顯著升高，從而有效防治PMOP。其部分療效機制是中、高劑量金剛丸均使PMOP模型大鼠骨組織Hippo信號通路Mst2、Lats1轉錄下調，可能導致MST2、LATS1翻譯、磷酸化減慢，從而減慢磷酸化TAZ而促進其轉位入核；使通路Taz轉錄上調，可能導致TAZ翻譯加快，均可使TAZ入核加快，結合RUNX2，共同促進下游成骨靶基因(如堿性磷酸酶、骨鈣素等)轉錄，促進成骨細胞分化和成骨，從而有效防治PMOP。

本研究表明，骨組織Hippo信號通路核心基因Mst2、Lats1 mRNA表達上調、Taz mRNA表達下調可能是PMOP的發(fā)病機制之一；金剛丸可能通過下調骨組織Hippo信號通路核心基因Mst2、Lats1 mRNA表達、上調Taz mRNA表達的機制，有效防治PMOP。本研究豐富了“腎藏精生髓主骨”這一中醫(yī)理論的科學內涵，并為防治PMOP提供了新的有效靶點。未來可以進一步從Hippo信號通路的上游調控因子乃至胞外信號著手，深入探索中醫(yī)藥防治PMOP的作用機制。