童夢(mèng)莎 鄭陽 任聰林 林福 付坤飛 孫杭凱 吳子豪 全仁夫

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053

2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院，浙江 杭州 312001

3.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 312001

到目前為止，修復(fù)骨缺損仍是臨床醫(yī)生面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。目前臨床上多采用自體骨移植或同種異體骨移植，但是傳統(tǒng)方法存在供體部位發(fā)病率高及異體移植排異反應(yīng)大等缺點(diǎn)，骨組織工程為骨缺損提供了新方法，其有3個(gè)要素：種子細(xì)胞、成骨誘導(dǎo)物和支架材料[1-2]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可作為新型組織工程骨的種子細(xì)胞，其作為種子細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)相比較更具有臨床意義[3-5]，它們提供了更連續(xù)的細(xì)胞供應(yīng)且可以避免在臨床實(shí)踐中使用人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，HESCs)所引起的倫理爭(zhēng)議[6]，有研究報(bào)道iPS-MSCs在動(dòng)物應(yīng)用中有很大治療潛能[7-9]。許多中草藥被證實(shí)有促骨愈合的作用[10-12]，其中骨碎補(bǔ)是較為常見的用于骨修復(fù)的中藥，大量研究表明骨碎補(bǔ)提取物可促進(jìn)動(dòng)物BMSCs或MC3T3-E1細(xì)胞系增殖及成骨分化，并且抑制破骨細(xì)胞的形成[13-16]，然而關(guān)于骨碎補(bǔ)總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD)干預(yù)iPS-MSCs增殖及成骨分化的報(bào)道并不多見。因此，本研究旨在研究骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)iPS-MSCs成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

iPS(課題組自備)；骨碎補(bǔ)提取物(購(gòu)于南京道斯夫科技公司)；地塞米松(D1756)、β甘油磷酸鈉(G9422)、茜素紅(A5533)(均購(gòu)于Sigma公司)；低糖DMEM培養(yǎng)基(11330057)、FBS(10099141)、GlutaMAXTM(100×)(30050087)、MEMNEAA(100×)(11140050)(均購(gòu)于Gibco公司)；青鏈霉素混合液(P1400)(Solarbio公司)；多聚甲醛(上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(C0037)、ALP試劑盒(P0321 S)(均購(gòu)于碧云天公司)；Trizol(12183555)(購(gòu)于Invitrogen公司)；SYBRGreenPCR試劑盒(A25743)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1691)(均購(gòu)于Thermo公司)；酶標(biāo)檢測(cè)儀(Thermo公司，MK-3)；Real-time檢測(cè)儀(ABI公司，ABI-7500)；倒置顯微鏡(Leica公司，DMIL)。

1.2 iPS誘導(dǎo)成MSCs

將IPS用Ⅳ型膠原酶于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化，后緩慢加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，沉降兩次后，加入MSC培養(yǎng)基重懸(含10%FBS、1%GlutaMAX、1%NEAA、雙抗、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸、0.2 mmol/L VitC的低糖DMEM培養(yǎng)液)，將單懸液接種于預(yù)先用1%明膠包被1 h的培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化2周后，為純化MSCs樣細(xì)胞，進(jìn)行傳代，一般培養(yǎng)至第4代后會(huì)出現(xiàn)形態(tài)相對(duì)一致的成纖維樣細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至第7代以純化細(xì)胞，之后可用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1.3 骨碎補(bǔ)提取物中總黃酮含量檢測(cè)

取柚皮苷對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成濃度為0.66、1.32、13.2、26.4、39.6、52.8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用紫外/可見分光光度計(jì)在283 nm下測(cè)定各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度(A)，其結(jié)果分別為0.030、0.046、0.371、0.697、0.972、1.297。

分析得TFRD含量標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程：以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.024 2X+0.028 7，R=0.999 1，線性范圍為0.66～52.8 μg/mL，表明良好線形關(guān)系，結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

取3份骨碎補(bǔ)提取物，每份16 mg。在283 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，結(jié)果見表1。

表1 骨碎補(bǔ)提取物中總黃酮含量

1.4 不同濃度骨碎補(bǔ)總黃酮培養(yǎng)基的制備

稱取不同量骨碎補(bǔ)總黃酮藥物，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，制作成0、15.63、31.25、62.5、125、250 μg/mL的6個(gè)濃度的TFRD培養(yǎng)基，0 μg/mL的骨碎補(bǔ)總黃酮培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。

1.5 CCK8法檢測(cè)iPS-MSCs增殖

iPS-MSCs接種于24孔培養(yǎng)板，分別加入0、15.63、31.25、62.5、125、250 μg/mL TFRD培養(yǎng)基干預(yù)，每個(gè)檢測(cè)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別干預(yù)24、48、72 h，去除培養(yǎng)基，加入10%CCK8溶液，于37 ℃，5%CO2環(huán)境下孵育1 h，吸取100 μL培養(yǎng)液至96孔培養(yǎng)板中，酶標(biāo)儀以450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

1.6 ALP活性檢測(cè)及茜素紅染色定量分析

iPS-MSCs接種于相應(yīng)培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)按增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取相應(yīng)濃度骨碎補(bǔ)總黃酮培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行ALP活性檢測(cè)及茜素紅染色定量分析，細(xì)胞培養(yǎng)液按照ALP試劑盒方法酶標(biāo)儀測(cè)定520 nm處吸光度值。4%多聚甲醛固定；用0.1%的茜素紅染液中染色30 min，于倒置顯微鏡下觀察拍照。茜素紅定量分析：用1 mL10%氯化十六烷吡啶室溫浸泡20 min，用560 nm的分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.7 RT-PCR 檢測(cè)

iPS-MSCs誘導(dǎo)14 d后，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)熒光PCR將獲取到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算各組2-△△CT值，即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 s，共40個(gè)循環(huán)。各檢測(cè)基因引物序列見表2。

表2 RT-PCR目的基因引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析各數(shù)值間差異的顯著性，采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)(Dunnett雙側(cè)檢驗(yàn))，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TFRD對(duì)iPS-MSCs增殖的影響

發(fā)現(xiàn) 125、250 μg/mL 濃度的TFRD抑制 iPS-MSCs 增殖生長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)選用 0、15.63、31.25、62.5 μg/mL濃度干預(yù) iPS-MSCs 的成骨分化。見圖2。

圖2 不同濃度骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)iPS-MSCs增殖

2.2 ALP活性檢測(cè)及茜素紅染色定量分析

ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個(gè)濃度組的ALP活性均高于0 μg/mL對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中31.25 μg/mL濃度組的ALP活性最好(圖3)；茜素紅染色顯示15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個(gè)濃度組的礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色的陽性面積和數(shù)量均高于0 μg/mL對(duì)照組。定量分析結(jié)果也顯示15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個(gè)濃度組的礦化結(jié)節(jié)量高于0 μg/mL對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖3 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)結(jié)果(**P<0.01)

圖4 茜素紅染色結(jié)果

2.3 TFRD對(duì)iPS-MSCs中成骨相關(guān)OCN、Collagen I mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示 15.63、31.25、62.5 μg/mL 3個(gè)濃度組的 OCN、Collagen I mRNA 表達(dá)量均高于 0 μg/mL 對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

圖5 骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)14 d iPS-MSCs OCN 和 Collagen Ⅰ mRNA 表達(dá)情況(**P<0.01)

3 討論

骨組織工程最佳細(xì)胞來源的選擇和使用是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題，BMSCs是目前應(yīng)用最廣泛的替代或再生受損骨組織的干細(xì)胞來源，但骨組織工程理想的細(xì)胞來源應(yīng)該具有無免疫排斥反應(yīng)、擴(kuò)增迅速、數(shù)量功能充足及獲取方便且符合倫理的優(yōu)點(diǎn)[17]。而iPSCs擴(kuò)增能力強(qiáng)，在特定的誘導(dǎo)條件下能夠向人體各種體細(xì)胞進(jìn)行分化，并有研究證明從iPS中獲得的MSCs具有安全的治療性基因整合，可以顯著降低腫瘤的發(fā)病率[18-20]，其能通過旁分泌發(fā)揮抗炎及營(yíng)養(yǎng)作用[1]，且有大量研究證明iPS-MSCs在骨與軟骨再生的細(xì)胞治療具有極大潛力[21-23]。

《素問·陰陽應(yīng)象大論》：“腎生骨髓?！敝嗅t(yī)認(rèn)為骨不愈因以補(bǔ)腎壯骨為治療原則。骨碎補(bǔ)味苦性溫，歸肝、腎經(jīng)，TFRD為其中發(fā)揮藥理作用的主要活性物質(zhì)，具有促骨修復(fù)、抗骨質(zhì)疏松、抑制炎癥反應(yīng)等作用[24]，且其毒副作用低。研究證明TFRD通過激活Wnt/β-catenin、BMP、Notch、Runx2等靶向信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分化，同時(shí)可以抑制巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松及促骨折愈合的作用[25-28]。實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道TFRD可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中ALP活性及礦化結(jié)節(jié)量，并增加OCN和Collagen I的表達(dá)[13,29-30]，可能通過上調(diào)兩者的表達(dá)去促進(jìn)成骨，所以本實(shí)驗(yàn)采用iPS-MSCs作為種子細(xì)胞，TFRD作為成骨誘導(dǎo)劑，研究TFRD對(duì)iPS-MSCs成骨分化影響，為骨組織工程中誘導(dǎo)骨重建的有效方法的發(fā)展提供理論支持。

本實(shí)驗(yàn)從骨碎補(bǔ)中提取有效成份TFRD，經(jīng)測(cè)定，該提取物中總黃酮含量近達(dá)95%。為了評(píng)估TFRD干預(yù)iPS-MSCs成骨分化的合適濃度，本研究選用0、15.63、31.25、62.5、125、250 μg/mLTFRD培養(yǎng)基，通過CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)125、250 μg/mL濃度的TFRD抑制iPS-MSCs增殖生長(zhǎng)，因此，本研究選用濃度低于62.5 μg/mL的TFRD干預(yù)iPS-MSCs的成骨分化。堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、I型膠原(collagen I)及鈣結(jié)節(jié)是評(píng)估成骨分化的重要標(biāo)志。其中ALP及鈣沉積在成骨分化早期即有表達(dá)，ALP通過將磷酸酯轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷來促進(jìn)骨基質(zhì)礦化，鈣結(jié)節(jié)是礦化的重要標(biāo)志[31-32]，結(jié)果顯示TFRD在0～31.25 μg/mL濃度內(nèi)呈劑量依賴性地促進(jìn)iPS-MSCs鈣結(jié)節(jié)形成以及增加ALP活性，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，0～31.25 μg/mL濃度內(nèi)呈劑量依賴性地促進(jìn)OCN、Collagen I的基因表達(dá)，其中31.25 μg/mL濃度組的OCN、Collagen I的基因表達(dá)增加最明顯，而OCN和Collagen I都是成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可刺激成骨細(xì)胞粘附與分化，是成骨分化晚期的重要標(biāo)志[33-34]，進(jìn)一步說明合適濃度的TFRD具有促進(jìn)iPS-MSCs成骨分化的作用。

綜上所述，骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過促成骨關(guān)鍵因子OCN和collagen I的表達(dá)促進(jìn)iPS-MSCs向成骨細(xì)胞分化，iPS-MSCs有作為新型組織骨工程種子細(xì)胞的潛力，骨碎補(bǔ)有望成為天然的成骨誘導(dǎo)劑，下一步將用骨碎補(bǔ)總黃酮誘導(dǎo)分化iPS-MSCs于生物支架上作體外共培養(yǎng)研究。