任錕 吉鴻濤 韓磊 李彥杰

河南省中醫(yī)院康復(fù)科，河南 鄭州 450000

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是從骨髓中分離出來的干細(xì)胞，具有自我復(fù)制和多項(xiàng)分化的潛能[1]。誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，是目前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。研究表明多種單味或復(fù)方中藥能夠調(diào)控BMSCs的成骨分化[2]。水蛭是一種傳統(tǒng)中藥，具有活血破瘀通經(jīng)消積等功效，在骨科疾病治療中有廣泛的使用[3]。有研究表明水蛭能夠提升骨損傷大鼠骨愈合相關(guān)基因的表達(dá)并促進(jìn)骨折愈合[4]。目前還未有研究探討水蛭對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。水蛭素是水蛭的提取物和活性成分[5]，本課題觀察水蛭素對BMSCs細(xì)胞成骨分化的影響，并探討其分子機(jī)制，為水蛭素的藥理研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs(ATCC? PCS-500-012?)購于美國菌種保藏中心；水蛭素凍干粉購于上海源葉生物科技有限公司(批號：S31625)；BCIP/NBT染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號：I023-1-1)；茜素紅染色液購于上海尚寶生物科技有限公司(批號：R23312)。Runx2(sc-390351)、Osterix(sc-393325)、COL1A1(sc-59772)、VEGF(sc-7269)、Notch1(sc-376403)、Jagged1(sc-390177)、CBF1(sc-271128)、β-actin(sc-84322)蛋白一抗和二抗(sc-2005)購于美國Santa Cruz公司。

1.2 MTT檢測細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)于河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。BMSCs細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素和鏈霉素的DEME培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。水蛭素凍干粉用DEME培養(yǎng)基配置為20 ATU/mL的母液。取對數(shù)期生長的BMSCs細(xì)胞分組培養(yǎng)。對照組：正常培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞；誘導(dǎo)組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入成骨誘導(dǎo)液(含100 mmol/L地塞米松，50 mg/L維生素C和10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉)；水蛭素組：細(xì)胞培養(yǎng)基加入成骨誘導(dǎo)液的同時(shí)分別加入低濃度(1 ATU/mL)、中濃度(10 ATU/mL)或高濃度(20 ATU/mL)水蛭素。每24 h換液一次，培養(yǎng)7 d。棄去原有培養(yǎng)基后每孔加入終濃度為5 g/L的MTT，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)4 h。棄去上清，隨后在每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)在490 nm波長處檢測吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞增殖率=(OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞分組培養(yǎng)一周后，加入0.5%胰蛋白酶進(jìn)行消化收集細(xì)胞。加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)。避光染色后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)

細(xì)胞分組培養(yǎng)一周后，Trizol試劑盒提取總RNA并檢測其濃度。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR檢測基因的表達(dá)。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，隨后72 ℃延伸10 min。以內(nèi)參基因β-actin為對照，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA的相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 BCIP/NBT試劑盒檢測堿性磷酸酶

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平采用BCIP/NBT試劑盒進(jìn)行檢測。將BMSCs細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24孔板中，24 h后加入成骨誘導(dǎo)液和水蛭素分組處理，培養(yǎng)一周后，按試劑盒說明加入BCIP/NBT工作液進(jìn)行染色，用PBS清洗后觀察染色結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 茜紅素染色檢測礦化結(jié)節(jié)

細(xì)胞分組培養(yǎng)一周后，加入40 g/L的多聚甲醛在室溫下孵育20 min，隨后使用茜素紅染色液于37 ℃染色5 min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)并記錄。

1.7 Western blot檢測

BMSCs細(xì)胞分組培養(yǎng)一周后，加入PBS緩沖液清洗3次，隨后加入蛋白裂解液反應(yīng)30 min，然后用SDS-PAGE電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)膜1 h后，加入5%脫脂牛奶在室溫下進(jìn)行1 h的封閉。分別加入待測蛋白一抗4 ℃過夜，加入二抗室溫孵育1 h。用凝膠成像儀對條帶進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與對照組相比，加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)的誘導(dǎo)組BMSCs細(xì)胞增殖顯著提升(P<0.05)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加低劑量的水蛭素后，BMSCs的細(xì)胞增殖較對照組沒有明顯改變，但在中劑量和高劑量水蛭素處理組中，細(xì)胞增殖提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且與中劑量水蛭素組相比，高劑量水蛭素組細(xì)胞增殖升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選取高劑量20 ATU/mL作為水蛭素處理濃度。

圖1 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

2.2 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡低于對照組，水蛭素組BMSCs細(xì)胞凋亡低于誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響

2.3 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組相比，誘導(dǎo)組BMSCs細(xì)胞中成骨基因Runx2、Osterix和COL1A1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著提升(P<0.05)。同時(shí)，加入水蛭素處理的BMSCs細(xì)胞中成骨基因的mRNA和蛋白表達(dá)高于誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨基因表達(dá)的影響

2.4 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP蛋白表達(dá)的影響

BCIP/NBT染色測定ALP蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖4。與對照組相比，誘導(dǎo)組ALP表達(dá)顯著增多。同樣，水蛭素組的ALP蛋白表達(dá)較誘導(dǎo)組顯著提升。

圖4 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP蛋白表達(dá)的影響(×100)

2.5 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的影響

如圖5所示，茜紅素染色后觀察BMSCs細(xì)胞，對照組和誘導(dǎo)組均未見明顯礦化結(jié)節(jié)，但誘導(dǎo)組較對照組顏色加深。水蛭素細(xì)胞可見明顯大小不一的紅褐色礦化結(jié)節(jié)。

圖5 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的影響(×200)

2.6 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中VEGF/Notch1信號通路的影響

如圖6所示，與對照組比較，誘導(dǎo)組和水蛭素組BMSCs細(xì)胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表達(dá)量均升高，并且水蛭素組高于誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中VEGF/Notch1信號通路的影響

3 討論

骨髓干細(xì)胞因其在自體移植和體外培養(yǎng)等多方面的優(yōu)勢，在多種疾病的臨床治療中具有重要的應(yīng)用前景[6]。中醫(yī)臨床上常用多種中藥治療促進(jìn)骨損傷愈合，研究也證實(shí)了多種中藥可通過提升骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化促進(jìn)骨愈合[7]。有研究表明水蛭素可應(yīng)用在骨愈合、骨關(guān)節(jié)炎及其他骨科疾病的治療中，但關(guān)于其作用機(jī)制的研究較少[8]。

本研究選取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs為靶標(biāo)進(jìn)行水蛭素藥理作用研究。加入成骨誘導(dǎo)液的BMSCs細(xì)胞增殖水平顯著提升，說明成骨誘導(dǎo)能夠提升BMSCs的細(xì)胞增殖，此結(jié)果與前人一致[9]。水蛭素在低濃度時(shí)對細(xì)胞增殖沒有影響，但是中高濃度的水蛭素明顯促進(jìn)成骨誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞的增值，可見水蛭素對BMSCs細(xì)胞增殖的提升作用具有一定的濃度依賴性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取了對BMSCs細(xì)胞增殖影響效果更大的高濃度水蛭素進(jìn)行。成骨細(xì)胞分化成熟過程中也伴隨著細(xì)胞凋亡的減少[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蛭素降低了成骨誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞凋亡。

Runx2是成骨細(xì)胞分化早期的重要標(biāo)志物之一，可激活一系列下游成骨基因的轉(zhuǎn)錄，參與成骨分化的調(diào)節(jié)[11]。Osterix和COL1A1在骨形成的膠原蛋白分泌和骨鈣化等過程中起重要作用，同樣是成骨分化的重要參與因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)水蛭素促進(jìn)成骨誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞中Runx2、Osterix和COL1A1的表達(dá)，證明水蛭素和成骨分化之間的聯(lián)系。另外，ALP和礦化結(jié)節(jié)常被用于檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化水平[13]。本研究中水蛭素的處理明顯提升了BMSCs細(xì)胞中ALP的水平，并且在加入水蛭素處理的細(xì)胞中，觀察到明顯的礦化結(jié)節(jié)。以上結(jié)果表明，水蛭素對BMSCs細(xì)胞的成骨分化有促進(jìn)作用。

在骨愈合大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)水蛭素可以正向調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)[4]。另有研究表明，水蛭素在血管內(nèi)皮細(xì)胞中激活VEGF/Notch1信號通路[14]。VEGF/Notch1信號通路參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)[15]。VEGF對BMSCs的增殖和分化均有促進(jìn)作用[16]。成骨分化過程中，Notch1通路中的受體和Jagged1配體結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而激活下游因子CBF1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化[17]。本研究結(jié)果顯示，水蛭素顯著提升了成骨誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表達(dá)，提示水蛭素對細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)作用可能是由上調(diào)VEGF/Notch1通路產(chǎn)生的。成骨分化的過程被多種細(xì)胞因子和信號通路所調(diào)節(jié)[18]。在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)水蛭素對VEGF/Notch1的調(diào)控在成骨分化中的作用，并探索水蛭素對其他成骨分化相關(guān)信號通路的影響。

綜上，本研究以水蛭素對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用為切入點(diǎn)，在成骨誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞中測定出其對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，對細(xì)胞凋亡有抑制作用，提升細(xì)胞中成骨基因Runx2、Osterix和COL1A1的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞中ALP水平的提升和礦化結(jié)節(jié)的生成，并且上調(diào)細(xì)胞中VEGF/Notch1信號通路。此結(jié)果說明水蛭素能夠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并且其作用可能是通過激活VEGF/Notch1通路產(chǎn)生的，為理解水蛭素的藥理作用提供理論依據(jù)。今后，還需進(jìn)一步建立動(dòng)物模型探索水蛭素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用，并探索其作為單方中藥試劑或輔助試劑對骨科疾病可能的治療作用。