袁濤 姜宇

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二人民醫(yī)院骨科，江蘇 無錫 214002

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，江蘇 無錫 214002

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)類藥物通常用于治療多種疾病，包括炎癥和自身免疫性疾病[1]；然而長期使用GCs會引起骨組織損傷，最終導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)[2]。骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病，其特征是骨密度降低，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、骨折風(fēng)險增加[3]。GIOP是最常見的由藥物引起的骨質(zhì)疏松癥類型，也是第二大常見的骨質(zhì)疏松癥類型[4]。強的松龍(PN)是一種糖皮質(zhì)激素類藥物，具有強大的抗炎和免疫抑制特性[5]。文獻報道，長期使用PN會導(dǎo)致骨密度下降和骨丟失，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[6]。在細(xì)胞內(nèi)，GCs及其類似物通過GC受體(GR，也稱為nr3c1)調(diào)節(jié)下游基因的表達。

斑馬魚是一種優(yōu)秀的模型生物，并已成功應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)研究[7]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地建立了斑馬魚nr3c1-突變體，用于研究斑馬魚的骨礦化和骨代謝相關(guān)基因的表達，同時評價了nr3c1在骨代謝相關(guān)基因表達調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚養(yǎng)殖與培養(yǎng)

成年AB品系斑馬魚在28 ℃、14 h/10 h的光/暗周期下，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)，每天投喂3次。為了獲得胚胎，將雄性和雌性斑馬魚在晚上配對，第2天在開燈后1 h內(nèi)雌性斑馬魚產(chǎn)卵。將胚胎放入10 cm厚的培養(yǎng)皿中，并用亞甲基藍(0.3 ppm)加雞蛋水，在28 ℃的光控(14 h/10 h明/暗)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 nr3c1突變斑馬魚的選育

本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立nr3c1-突變體。本研究在第2外顯子設(shè)計靶位點，并在體外合成nr3c1 gRNA，然后將nr3c1 gRNA(100、50和25 pg)和Cas9-Capped-mRNA(300 pg)在單細(xì)胞階段共注射到斑馬魚胚胎中。然后將注射的胚胎保存在28.5 ℃的E3培養(yǎng)基(5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2和0.33 mmol/L MgSO4)中，并在2 DPF下提取3組(每組10個胚胎)的gDNA，然后擴增出含有nr3c1靶位點的243bp DNA片段，用T7內(nèi)切酶I(New England Biolabs)將7 μL擴增產(chǎn)物在37 ℃下酶切3 h。用美國國立衛(wèi)生研究院的ImageJ定量分析裂解帶和未裂解帶的強度，并估計突變頻率。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD-19 T(Takara Bio Inc.)用于測序分析。為了鑒定胚系傳遞的突變，將顯微注射的魚胚胎(F0)培育到成年，然后將F0魚與WT斑馬魚進行異型雜交，產(chǎn)生F1胚胎。然后從每個雜交組合中收集10個F1胚胎進行g(shù)DNA提取和酶消化。攜帶可遺傳突變的F1胚胎的同胞被培育到成年，并通過PCR擴增和剪鰭DNA測序重新鑒定了每一條F1魚。

1.3 阿爾新藍染色及全標(biāo)本包埋骨骼染色

為了觀察受精后96 h胚胎前骨骼的發(fā)育變化，用立體顯微鏡獲取圖像(Leica，Wetzlar，Germany)，并用阿爾新藍染色，重復(fù)3次。用Image J測量顱間距離(ICD)、下頜骨長度(LJL)和頸椎軟骨長度(CCL)。

斑馬魚幼體的茜素紅染色實驗如前所述[8]。用立體顯微鏡(Leica)采集圖像。本研究進行了數(shù)字圖像分析，以量化染色區(qū)域的表面和密度。

1.4 斑馬魚樣品RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR

用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取30多條幼體的總RNA，用SuperScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為95 ℃、10 s和60 ℃、30 s，進行40個循環(huán)。以看家基因β-肌動蛋白為對照，所有結(jié)果均標(biāo)準(zhǔn)化為該基因的表達水平。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

對來自WT和nr3c1-/-樣本的約100條幼體進行了蛋白質(zhì)印跡分析。

1.6 熒光素酶報告測定

將mmp9、alp和acp5a啟動子克隆到pGL4.17載體中，構(gòu)建mmp9、alp和acp5a-Luc載體，并與nr3c1表達載體共轉(zhuǎn)染HEK 293 T細(xì)胞進行雙熒光報告實驗。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。兩組或更多組之間的統(tǒng)計差異分別使用t檢驗和單因素方差分析，然后進行Student-Newman-Keuls檢驗。所有實驗至少重復(fù)3次。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 nr3c1缺失突變斑馬魚的選育

在斑馬魚中，糖皮質(zhì)激素受體由nr3c1基因編碼，該基因包含9個外顯子。起始密碼子ATG位于第二外顯子，編碼蛋白由746個氨基酸組成。在與ATG位點相鄰的第二個外顯子上預(yù)測并選擇了該基因上的gRNA靶位點(圖1A)。誘變效率實驗結(jié)果表明，注射100、50和25 pg的gRNA組的效率分別為90%、87%和88%(圖1B)。將PCR片段克隆到測序載體PMD-19 T后，單克隆測序顯示F0中nr3c1 gRNA靶點有4種不同類型的插入突變(圖1C)。因此，這些顯微注射的F0胚胎的同胞被培育到成年，并與WT魚雜交產(chǎn)生F1胚胎。獲得了兩個可遺傳突變，即5-bp缺失和7-bp缺失，并與含有相同突變的F1魚雜交，獲得純合子nr3c1突變系(圖1 D、1E)。Western blotting結(jié)果表明，在nr3c1-突變體中未檢測到NR3C1蛋白(圖1F)。這些結(jié)果表明該nr3c1-突變體是一個無義突變體。

2.2 nr3c1-突變體的軟骨發(fā)育異常

對4 DPF、5 DPF和6 DPF斑馬魚幼體的軟骨進行阿爾新藍染色，結(jié)果表明，4 DPF時，PN組、nr3c1突變組和nr3c1突變PN處理組與WT組相比，頭面部軟骨發(fā)育明顯減慢(圖2A～2 D)，尤其是nr3c1突變PN處理組，難以觀察到Meckels軟骨(圖2 D)。5 DPF時，將主要軟骨結(jié)構(gòu)染色，PN組和nr3c1突變PN組與WT組比較，前側(cè)篩板、外側(cè)緣McGills軟骨、舌內(nèi)側(cè)軟骨和后角形態(tài)無明顯差異(圖2E～2 H)。然而，nr3c1突變組體現(xiàn)出角質(zhì)支氣管部和角質(zhì)膜形成的延遲(圖2 G)。6 DPF時，各組顱面軟骨清晰可見，軟骨形態(tài)無明顯變化(圖2I～2 L)。為了進一步評估軟骨的發(fā)育變化，測量了6 DPF斑馬魚幼體的軟骨距離，即顱內(nèi)距離(ICD)、下頜長度(LJL)和角軟骨長度(CCL)(圖3A)。PN處理沒有影響軟骨與對照組之間的距離(圖3B～3 D)；相反，在nr3c1突變體中，軟骨發(fā)育距離顯著縮短，表明nr3c1突變導(dǎo)致了頭面部骨骼變小(圖3B～3 D)。此外，用PN處理nr3c1-突變體后，3個參數(shù)沒有顯著差異(圖3B～3 D)。為了探討顱面骨缺損背后的原因，在6 DPF中計算了頸椎軟骨中的軟骨細(xì)胞數(shù)(圖4A～4 D)。結(jié)果表明，nr3c1突變體的軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖4E)。這些結(jié)果表明，nr3c1的缺失影響軟骨的發(fā)育，而PN影響軟骨發(fā)育的具體機制尚需進一步研究。

圖2 nr3c1-突變體的軟骨異常 WT組(A、E、I組)、25 μmol/L PN處理組(B、F、J組)、nr3c1-/-突變組(C、G、K組)和25 μmol/L PN處理的nr3c1-/-突變組(D、H、L組)受精后4～6 d進行軟骨阿爾辛藍染色。

圖3 nr3c1-突變體軟骨長度異常

圖4 nr3c1的突變減少了軟骨細(xì)胞的數(shù)量 WT組(A)、PN處理組(B)、nr3c1-/-組(C)和PN處理的nr3c1-/-組(D)顯示角軟骨發(fā)育情況；E為計算軟骨細(xì)胞的數(shù)量。

2.3 nr3c1-突變體骨礦化減少

取7 DPF、8 DPF、9 DPF的幼魚進行茜素紅染色(圖5A)，結(jié)果顯示，在7 DPF，與WT相比，PN處理導(dǎo)致骨礦化顯著減少(圖5B)，nr3c1突變組顯示骨礦化顯著減少(圖5C)，nr3c1突變與PN處理導(dǎo)致更嚴(yán)重的骨礦化減少(圖5 D)。在8 DPF和9 DPF，PN處理和nr3c1突變后的骨礦化表型更為明顯(圖5E～5 L)。用Image J測量礦化面積，結(jié)果表明，在PN處理后和nr3c1-突變體中，礦化面積在7 DPF(圖6A)、8 DPF(圖6B)和9 DPF(圖6C)處與對照組相比顯著減少。這些結(jié)果表明，nr3c1的缺失和PN處理均會影響斑馬魚幼體的骨礦化。

圖5 nr3c1-突變體組和PN處理的nr3c1-突變體組的骨礦化 受精后7～9 d的斑馬魚幼體用茜素紅在(A、E和I) WT、(B、F和J) PN處理組、(C、G和K) nr3c1-突變體組和(D、H和L) PN處理的nr3c1-突變體組中染色。

圖6 nr3c1-突變體組和PN處理的nr3c1-突變體組中骨礦化的定量分析

2.4 nr3c1-突變體骨代謝相關(guān)基因表達模式的改變

為了探究nr3c1對骨發(fā)育影響的機制，采用qRT-PCR方法檢測了nr3c1-突變組和PN處理組的骨代謝相關(guān)基因的表達水平。結(jié)果表明，nr3c1-突變體的nr3c1基因表達較WT組下調(diào)。在PN處理組，nr3c1表達下調(diào)，但不顯著(圖7A)。

研究表明，mmp9、mmp13和sparc參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)功能，并通過影響ECM代謝參與骨代謝[9-10]。mmp9和mmp13在以前的研究中已經(jīng)被確定為PN的靶基因，這兩個基因的表達在PN處理后顯著增加(圖7B)。mmp9和mmp13的表達與WT中沒有顯著差異，而在nr3c1突變體、5 DPF和8 DPF幼體中，這兩個基因的表達降低(圖7B、7C)。在WT和nr3c1-突變組中，PN在5 DPF后上調(diào)sparc的表達。與野生型相比，nr3c1-突變體的sparc表達無顯著差異。在8 DPF時，sparc的表達水平在4個樣本組之間沒有顯著差異(圖7D)。

runx2b、entpd5a、spp1和alp是涉及骨代謝的成骨細(xì)胞相關(guān)基因[11-12]。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，nr3c1-突變體中的成骨細(xì)胞分化基因runx2b的表達不受PN處理的影響(圖7E)。在5 DPF和8 DPF，PN治療后entpd5a的表達與對照組相比沒有顯著變化(圖7F)。在nr3c1-突變體中，entpd5a的表達水平顯著下調(diào)，PN沒有改變其在nr3c1-突變體中的表達(圖7F)。在nr3c1-突變體中，spp1的表達在5 DPF時表達降低，但差異不顯著(圖7G)。在8 DPF時，與WT相比，nr3c1-突變體中spp1的表達水平顯著下調(diào)，而PN并不改變nr3c1-突變體中的這種下調(diào)(圖7G)。堿性磷酸酶(ALP)是成骨細(xì)胞的標(biāo)志物。在5 DPF時，PN沒有誘導(dǎo)alp的表達，而在8 DPF時，PN顯著增加了alp的表達(圖7H)。與WT組相比，在5 DPF和8 DPF nr3c1-突變體中，alp的表達下調(diào)，而在nr3c1-突變體中，PN上調(diào)了alp的表達，但其水平?jīng)]有達到WT組的水平(圖7H)。

ctsk、acp5a、rankl和opg與骨代謝過程中的破骨細(xì)胞有關(guān)[13-15]。qRT-PCR結(jié)果顯示，與WT組相比，PN處理組ctsk在5 DPF時表達上調(diào)，在nr3c1-突變體中表達上調(diào)(圖7I)。在8 DPF時，PN處理不改變ctsk的表達。在nr3c1-突變體中，ctsk的表達水平顯著下調(diào)，并不受PN的影響(圖7I)。與WT組相比，nr3c1突變體中acp5a的表達下調(diào)，PN在5 DPF時促進了nr3c1-突變體中acp5a的下調(diào)(圖7J)。rankl和opg是兩個功能相反的配體，它們分別編碼激活和抑制破骨細(xì)胞分化的蛋白。在5 DPF時，PN處理組和nr3c1-突變體的兩個基因表達下調(diào)。PN處理組5 DPF時rankl和opg的表達水平與WT組相比無顯著差異，而在8 DPF時，nr3c1-突變體的rankl和opg表達水平較WT組明顯下調(diào)。在nr3c1-突變組，PN上調(diào)了opg的表達，但不影響ranklL的表達(圖7K～7L)。以上數(shù)據(jù)表明，nr3c1影響斑馬魚破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達。

圖7 nr3c1突變改變骨代謝相關(guān)基因的表達(用25 μmol/L PN處理WT和nr3c1突變胚胎，并在受精后第5天和第8天收集)

2.5 GC-NR3C1介導(dǎo)的骨相關(guān)基因表達

雙熒光報告實驗結(jié)果表明，PN或nr3c1單獨上調(diào)mmp9的表達，PN可進一步增強mmp9的表達(圖8A)。對堿性磷酸酶(alp)表達的分析顯示，與mmp9的結(jié)果相似(圖8B)。單獨使用PN并不能顯著上調(diào)acp5a，而單獨添加nr3c1則顯著上調(diào)acp5a。PN和nr3c1的加入增強了acp5a的這種上調(diào)表達(圖8C)。這些結(jié)果表明PN和NR3C1協(xié)同調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)基因的表達。

圖8 PN通過nr3c1調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)基因的表達(雙熒光素酶報告分析PN和nr3c1對骨代謝相關(guān)基因表達的影響)

3 討論

Paul等[16]發(fā)現(xiàn)PN顯著促進顱面骨的發(fā)育。本研究結(jié)果表明，PN對顱面骨發(fā)育沒有影響，這可能是由于PN濃度不同所致。然而，在nr3c1-突變體中，每個軟骨參數(shù)都顯著降低，這表明nr3c1的缺失抑制了顱面骨的發(fā)育。此外，25 μmol/L PN改變了由nr3c1缺失介導(dǎo)的軟骨表型。這一結(jié)果表明，過量的GC可以部分補償nr3c1信號通路的缺失(糖皮質(zhì)激素受體非依賴性通路)。

骨礦化是成骨細(xì)胞成熟和骨形成的重要過程[17]。在骨礦化涉及的蛋白質(zhì)中，entpd5a可以調(diào)節(jié)磷酸鹽的穩(wěn)定性[18]。根據(jù)定量結(jié)果，在nr3c1-突變體中entpd5a的表達顯著下調(diào)，但PN單獨不能抑制其表達，表明NR3C1是通過entpd5a途徑參與骨礦化的介質(zhì)之一。在斑馬魚nr3c1-突變體中，spp1的表達顯著下調(diào)，表明nr3c1也可以通過spp1影響骨礦化。先前的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的PN會抑制斑馬魚成骨細(xì)胞的分化和數(shù)量[19]。在小鼠中，nr3c1被發(fā)現(xiàn)降低成骨細(xì)胞分化和相關(guān)基因的表達[20]。因此，成骨細(xì)胞是nr3c1發(fā)揮作用的靶細(xì)胞，并對骨代謝產(chǎn)生影響，但nr3c1如何調(diào)控entpd5a和spp1從而影響骨礦化尚需進一步分析。

破骨細(xì)胞能夠吸收骨組織，在骨重建中發(fā)揮重要作用[15]。先前的動物和細(xì)胞實驗表明，GCs可以促進破骨細(xì)胞分化，并會導(dǎo)致GIOP[21]。然而，在斑馬魚中，PN被發(fā)現(xiàn)可以減少破骨細(xì)胞數(shù)量并增加凋亡[19]；在小鼠中，破骨細(xì)胞可以通過GR介導(dǎo)的途徑走向凋亡，隨后的研究表明PN可以抑制破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)在nr3c1-突變體中ctsk、acp5a、rankl和opg表達下調(diào)，表明nr3c1可以調(diào)節(jié)許多破骨細(xì)胞基因的表達。RANKL/OPG比例對破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要[22]。而GR-二聚體是RANKL/OPG軸的重要調(diào)節(jié)因子[23]。定量結(jié)果表明，OPG和RANKL都是nr3c1的靶基因。本研究未對nr3c1-突變體中RANKL/OPG的比例進行統(tǒng)計分析，該比例是否影響成骨細(xì)胞的分化和增殖還有待進一步分析。

在細(xì)胞核內(nèi)，激活的nr3c1以二聚體的方式與GRE元件或其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，以調(diào)節(jié)基因表達。在本研究評估的基因中，GC/Nr3c1可以通過4種方式調(diào)節(jié)與骨代謝有關(guān)的基因的表達。第一種途徑是通過GC-Nr3c1途徑，涉及mmp13、mmp9和alp。其次，在nr3c1突變的情況下，GC可以通過多種途徑調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)基因的表達，例如sparc。第三，nr3c1調(diào)控基因的表達與GCs無關(guān)，如entpd5a、spp1、acp5a、opg和rankl。第四，GC調(diào)節(jié)基因的表達既可以通過nr3c1途徑，也可以通過非nr3c1途徑，如alp。GC-Nr3c1途徑是GN發(fā)揮調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)基因作用的經(jīng)典途徑，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)從而影響骨結(jié)構(gòu)和骨相關(guān)細(xì)胞的微環(huán)境。在nr3c1突變的情況下GC也可通過非nr3c1途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、激活蛋白(AP)-1、核因子-κB等。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地獲得了斑馬魚nr3c1-突變體。利用該模型發(fā)現(xiàn)Nr3c1影響軟骨發(fā)育和骨礦化，并且Nr3c1突變改變了細(xì)胞外基質(zhì)、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達。進一步的實驗表明，GC/Nr3c1通過Nr3c1依賴和非Nr3c1途徑調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達。本研究為確定Nr3c1在骨代謝和發(fā)育中的作用提供了依據(jù)，同時為臨床治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥確定了新的效應(yīng)靶點。