劉旭良 周元敏 曾祥英 王兆杰 宋慧東 李伯庭

1. 廣州市第十二人民醫(yī)院骨外科，廣東 廣州 510620

2. 廣州市第十二人民醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510620

3. 廣州市第十二人民醫(yī)院供應(yīng)室，廣東 廣州 510620

4. 廣州市第十二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510620

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨質(zhì)被破壞為特征的一種代謝異常性疾病，骨脆性增加引起的骨折是導(dǎo)致老年患者致死及致殘的重要原因之一[1]。有研究[2]認(rèn)為腸道菌群失調(diào)產(chǎn)生的大量炎癥因子是導(dǎo)致OP患者破骨細(xì)胞骨吸收亢進(jìn)、骨量丟失加重的易感因素。益生菌是對(duì)人體腸道機(jī)能有益的一類微生物的總稱，可糾正腸道菌群失調(diào)，抑制炎癥反應(yīng)，維持腸道正常生理功能[3]。用益生菌制劑糾正腸道菌群失調(diào)及骨代謝異常，可能是治療OP的一種新思路。但益生菌制劑通過(guò)何種途徑預(yù)防、治療及影響骨代謝，目前還不十分明確。

PI3K/Akt信號(hào)通路是參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡及骨代謝異常的關(guān)鍵通路。已有研究證實(shí)，腸道菌群失調(diào)介導(dǎo)的腸炎癥反應(yīng)過(guò)程中，PI3K/Akt活化可加重腸道功能紊亂[4]，且PI3K/Akt通路活化可抑制FoxO1的磷酸化活化及核轉(zhuǎn)位，而引起破骨細(xì)胞死亡，影響骨代謝[5]，提示PI3K/Akt的活化可能是腸道菌群調(diào)節(jié)骨代謝過(guò)程中的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究擬從PI3K/Akt信號(hào)通路方面，探究益生菌制劑干預(yù)治療OP大鼠的骨代謝異常的潛在機(jī)制，以期為OP的抑菌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑及儀器：白色念珠菌(貨號(hào)：LA9490，北京索萊寶科技有限公司)；PI3K/AKT通路激活劑(貨號(hào)：M03755-LUP，北京百奧萊博科技有限公司)；益生菌制劑-枯草芽孢桿菌二聯(lián)活菌(媽咪愛)(貨號(hào)：S20020037，0.5 g/片，北京韓美藥品有限公司)；革蘭氏染液(貨號(hào)：D008，上海雅吉生物科技有限公司)；白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、Ⅰ型原膠原氨基端延長(zhǎng)肽(PINP)、β膠聯(lián)降解產(chǎn)物(β-CTX)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OC)等ELISA試劑盒購(gòu)自上海心語(yǔ)生物科技有限公司；HE及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色液(貨號(hào)：SY2022及T6823，北京伊塔生物科技有限公司及無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；PI3K、Akt、叉頭框蛋白O(FOXO)、骨保護(hù)素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANKL)等兔抗大鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam公司；DPX-NT雙能骨密度儀購(gòu)自美國(guó)Lunar公司；菌落計(jì)數(shù)器購(gòu)自西班牙IUL公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1月齡健康雄性SD大鼠90只，體重200～220 g，購(gòu)自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2021-0057]，于廣州市第十二人民醫(yī)院動(dòng)物房中常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定，經(jīng)廣州市第十二人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批號(hào)：IACUC-01(202101015)]，符合3R原則。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物處理及分組：取SD大鼠75只，參照文獻(xiàn)[6]灌胃109cfu/mL的白色念珠菌50 μL，1次/d，共7 d，建立腸道菌群失調(diào)模型(糞便含水量顯著增高，糞便桿球菌比例低于1∶1，為造模成功)共75只，并隨機(jī)分為模型組、益生菌制劑組、PI3K/AKT通路激活組、益生菌+通路激活組，另取15只大鼠予以自由飲用無(wú)菌生理鹽水，作為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組及模型組大鼠在分組后自由飲用無(wú)菌生理鹽水；益生菌制劑組參照文獻(xiàn)[7]按1 mL/200 g體重灌胃給予益生菌制劑-枯草芽孢桿菌二聯(lián)活菌，連續(xù)14 d；PI3K/AKT通路激活組參照文獻(xiàn)[8]經(jīng)腹腔注射PI3K/AKT通路激活劑-rh IGF(20 μg/kg)，1次/d，連續(xù)14 d進(jìn)行干預(yù)治療；益生菌+通路激活組腹腔注射PI3K/AKT通路激活劑-rh IGF的同時(shí)，灌胃給予益生菌制劑進(jìn)行治療。

1.2.2腸道菌群檢測(cè)：收集大鼠新鮮糞便，精密稱重后置于烘箱中烘干至恒重，檢測(cè)含水量(%)=(烘干前重量-烘干后重量)/烘干前重量×100 %。用無(wú)菌竹簽在潔凈載玻片上涂布糞便，厚薄適宜，待自然干燥后固定，行革蘭染色，用顯微鏡[100(物鏡)×10(目鏡)]觀察記錄菌群分布。

1.2.3血清血指標(biāo)檢測(cè)：將大鼠麻醉后，取腹主動(dòng)脈血2 mL，按ELISA試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)IL-6、IL-1、PINP、β-CTX、ALP及OC水平。

1.2.4骨質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)：運(yùn)用DPX-NT雙能骨密度儀對(duì)大鼠右側(cè)股骨頸進(jìn)行掃描(分辨率1.0 mm×1.0 mm，速度60 mm/s)以檢測(cè)骨密度；處死大鼠，取右側(cè)股骨，剔除表面的結(jié)締組織，于馬弗爐中550 ℃灰化至恒重，取出用分析天平稱取重量。取左側(cè)股骨頭，置入10 %中性甲醛固定液固定24 h，30 %甲酸脫鈣3 d，梯度乙醇脫水、二甲苯透明2 h，石蠟包埋，制成4 μm切片，常規(guī)HE及TRACP染色，制成病理標(biāo)本，在400倍顯微鏡下觀察，運(yùn)用Image-pro-plus圖像系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)TRACP染色切片中破骨細(xì)胞數(shù)目。

1.2.5Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：將左后側(cè)股骨頭置于液氮中凍存后敲碎，在液氮液中碾磨成粉末，加入預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，制膠后，取20 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)反應(yīng)，5 %脫脂奶粉封閉操作后，加入1∶600的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FOXO1、p-FOXO1、OPG、RANKL一抗及β-actin(1∶1 200)內(nèi)參抗體4 ℃孵育過(guò)夜，羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶二抗(1∶1 600)室溫孵育0.5 h，顯影液和定影液浸泡PVDF膜，晾干后，運(yùn)用ImageJ軟件分析條帶相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 益生菌制劑對(duì)大鼠糞便含水量及腸道菌群的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌升高(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌減少(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌降低(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌較模型組升高(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌較模型組減少(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠糞便含水量、腸桿菌、白色念球菌較益生菌制劑組升高(P<0.05)，腸球菌、雙歧桿菌(、乳酸桿菌較益生菌制劑組減少(P<0.05)，見圖1。

圖1 大鼠糞便含水量及腸道菌群比較

2.2 益生菌制劑對(duì)大鼠血清炎癥因子及骨生物學(xué)指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平升高(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平降低(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平較模型組升高(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平較模型組降低(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠血清IL-6、IL-1、β-CTX水平較益生菌制劑組升高(P<0.05)，PINP、ALP及OC水平較益生菌制劑組降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 大鼠血清炎癥因子及骨生物學(xué)指標(biāo)比較

2.3 益生菌制劑對(duì)大鼠骨密度及骨灰質(zhì)量的影響

與正常對(duì)照組[(226.17±12.42)mg/cm3,(769.86±25.93)mg]相比，模型組大鼠骨密度[(165.31±10.36)mg/cm3]及骨灰質(zhì)量[(640.32±20.21)mg]降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠骨密度[(216.00±14.48)mg/cm3]及骨灰質(zhì)量[(747.48±27.94)mg]升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠骨密度[(105.34±8.66)mg/cm3]及骨灰質(zhì)量[(569.64±17.86)mg]較模型組降低(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠骨密度[(177.28±15.08)mg/cm3]及骨灰質(zhì)量[(667.62±27.30)mg]較益生菌制劑組降低(P<0.05)。

2.4 益生菌制劑對(duì)大鼠骨病理學(xué)變化的影響

HE染色可見，正常對(duì)照組大鼠骨小梁排列有序且結(jié)構(gòu)致密。模型組大鼠可見股骨遠(yuǎn)端骨小梁排列稀疏且減少，骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊。益生菌制劑組大鼠骨小梁及骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于正常，PI3K/AKT通路激活組大鼠骨小梁間隔增寬，粗細(xì)不均勻。益生菌+通路激活組大鼠骨小梁變化較模型組相近，見圖3。

TRACP染色可見，破骨細(xì)胞陽(yáng)性染色呈粉紅色，模型組可見破骨細(xì)胞數(shù)目增多，骨吸收陷窩增大，破骨細(xì)胞數(shù)目[(16.38±1.05)個(gè)/mm2]高于正常對(duì)照組[(4.17±0.42)個(gè)/mm2],P<0.05。益生菌制劑組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)目[(7.00±0.78)個(gè)/mm2]較模型組減少(P<0.05)，PI3K/AKT通路激活組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)目[(25.28±2.06)個(gè)/mm2]較模型組進(jìn)一步升高(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)目[(16.08±1.08)個(gè)/mm2]較益生菌制劑組增多(P<0.05)，見圖3。

圖3 股骨遠(yuǎn)端組織HE與TRACP染色圖(×400)

2.5 益生菌制劑對(duì)大鼠PI3K/Akt/FOXO1通路蛋白及RANKL/OPG表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG表達(dá)升高(P<0.05)，OPG表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，益生菌制劑組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG降低(P<0.05)，OPG表達(dá)升高(P<0.05)；PI3K/AKT通路激活組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG表達(dá)較模型組升高(P<0.05)，OPG表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。益生菌+通路激活組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG表達(dá)較益生菌制劑組升高(P<0.05)，OPG表達(dá)較益生菌制劑組降低(P<0.05)，見圖4，表1。

表1 大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1、RANKL、RANKL/OPG及OPG表達(dá)比較

圖4 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FOXO1、FOXO1、RANKL、OPG蛋白表達(dá)免疫印跡圖

3 討論

臨床上常用促進(jìn)骨形成藥物或抑制骨吸收藥物來(lái)糾正OP引起的骨代謝失衡，但這些藥物雖能在一定程度上抑制骨量丟失的進(jìn)一步惡化，但卻并不能使丟失的骨量恢復(fù)[9]。腸道菌群可通過(guò)消化系統(tǒng)的分泌與吸收、機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，來(lái)影響雌激素類似物分泌及骨質(zhì)形成微量元素如鈣、磷的吸收及代謝、骨鈣形成等過(guò)程[10]。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，炎性因子如IL-6和TNF-α是強(qiáng)烈的骨吸收刺激因子，老年OP患者或絕經(jīng)后OP女性患者IL-6和TNF-α的升高，可抑制OPG產(chǎn)生，導(dǎo)致RANKL/OPG比例增加，破骨細(xì)胞吸收加速而出現(xiàn)骨丟失；而腸道菌群失調(diào)后可誘導(dǎo)腸內(nèi)炎癥的應(yīng)答，導(dǎo)致IL-6和TNF-α等溶骨性細(xì)胞因子大量釋放，這也解釋了腸炎患者更易患OP的可能原因[11]。PINP是反應(yīng)骨形成的指標(biāo)，β-CTX可降解PINP而可用于骨吸收的判定。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠出現(xiàn)糞便含水量增加、糞便中腸桿菌、白色念球菌等致病菌升高，腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌減少等腸道菌群失調(diào)癥狀后，也出現(xiàn)OP癥狀(IL-6和TNF-α升高，ALP、OC、PINP等促骨形成因子減少，β-CTX及破骨細(xì)胞骨吸收升高，RANKL/OPG比例增加，股骨骨密度、骨灰質(zhì)減少，股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨小梁斷裂及骨細(xì)胞減少等病理?yè)p傷嚴(yán)重)，提示腸道菌群失調(diào)性O(shè)P模型造模成功。

益生菌可激發(fā)糖類細(xì)菌活性、增加有機(jī)酸分泌、提高腸道酸性微環(huán)境、增強(qiáng)腸道抗菌能力、抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖，而維持腸道功能及菌群平衡。已有研究發(fā)現(xiàn)益生菌可抑制炎癥反應(yīng)，來(lái)降低破骨細(xì)胞形成，繼而減少骨破壞，并逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞減少[12]。卵巢切除鼠補(bǔ)充益生菌制劑-鼠李糖乳桿菌可改善腸道通透性，減輕腸道炎癥，改善骨密度[13]。Delgado-Ruiz等[14]發(fā)現(xiàn)益生菌治療法可通過(guò)抑制IL-6分泌及腸道炎癥反應(yīng)，來(lái)抑制卵巢去勢(shì)小鼠破骨細(xì)胞活性，而增加骨量，提示用益生菌制劑來(lái)治療OP可能是未來(lái)的新趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，用益生菌制劑-枯草芽孢桿菌二聯(lián)活菌灌胃治療后，大鼠糞便含水量及致病菌降低，益生菌升高提示菌群趨于正常，大鼠OP癥狀也較模型組明顯緩解，證實(shí)腸道菌群調(diào)節(jié)劑-益生菌制劑可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)。

PI3K/Akt通路是參與炎癥反應(yīng)及骨代謝失衡的關(guān)鍵通路之一。大量研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)后，血漿及腸道組織內(nèi)IL-6和TNF-α升高可刺激PI3K活化，PI3K通過(guò)D3-磷酸肌醇PH結(jié)構(gòu)域促進(jìn)Akt磷酸化，并負(fù)性調(diào)節(jié)肌醇-5-磷酸酶(SH2)，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體存活、分化、成熟及骨吸收，且PI3K/Akt通路的活化可通過(guò)誘導(dǎo)胱硫醚-β-合成酶(CBS)及轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達(dá)來(lái)生成內(nèi)源性硫化氫，從而抑制腸道動(dòng)力、加速腸通透性損傷及細(xì)菌移位，導(dǎo)致機(jī)體更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[15-16]。另外，PI3K/Akt通路下游FoxO1活化可與激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)相互作用，來(lái)促進(jìn)防御蛋白合成，而抵抗骨骼內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，維持成骨正常增殖，但PI3K/Akt通路的磷酸化途徑活化，可直接阻斷FoxO1依賴的DNA結(jié)合能力受損，引起成骨細(xì)胞凋亡、破骨細(xì)胞生成及骨吸收控制節(jié)點(diǎn)失衡，導(dǎo)致骨代謝異常及OP發(fā)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道菌群失調(diào)后，股骨組織中PI3K/Akt通路磷酸化活性升高，p-FoxO1升高而FoxO1活性降低，破骨細(xì)胞活性升高(破骨細(xì)胞數(shù)目增多，RANKL/OPG比例增加)，而用激活劑進(jìn)一步促進(jìn)PI3K/Akt通路磷酸化活性后，F(xiàn)oxO1活性進(jìn)一步降低，大鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的OP及菌群失調(diào)現(xiàn)象，提示PI3K/Akt通路活性升高，可加重腸道菌群失調(diào)及骨丟失。益生菌制劑干預(yù)治療組，PI3K/Akt通路處于抑制狀態(tài)，其菌群失調(diào)及骨丟失現(xiàn)象最輕，PI3K/Akt通路激活劑可明顯減弱益生菌制劑的抗OP及菌群失調(diào)作用。

綜上所述，益生菌制劑干預(yù)治療，可減弱大鼠菌群失調(diào)并糾正OP引起的骨代謝異常，且其作用可能與抑制PI3K/Akt通路激活有關(guān)。這為有效防治腸道菌群失調(diào)誘導(dǎo)的骨量減少及OP的治療提供新的思路，但腸道菌群失調(diào)患者極多，菌群種類繁雜，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，缺少特異性，PI3K/Akt通路在成骨及破骨中的調(diào)控作用爭(zhēng)議也較多，腸道菌群引起骨量減少的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。