鄒德勛 趙忠福 吳淼 李曉光

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨外二科，黑龍江 齊齊哈爾 161041

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低和骨組織微觀結(jié)構(gòu)惡化為特征的代謝性骨病，為個(gè)人和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。統(tǒng)計(jì)[2]顯示，在骨質(zhì)疏松癥患者中，超過50 %的女性和20 %的男性會發(fā)生骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折。目前以藥物治療為主，但多數(shù)藥物會引發(fā)不良反應(yīng)[3]，因此開發(fā)新型藥物對于骨質(zhì)疏松癥的治療具有重要意義。

c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是一種重要的MAPK家族蛋白，主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、分化、增殖和凋亡。JNK通路參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展，如癌癥、神經(jīng)退行性變、炎癥等[4-6]。研究表明，JNK通路的激活與骨質(zhì)疏松的發(fā)生有密切聯(lián)系。例如，Lee等[7]的研究證明甲基乙二醛通過JNK通路激活破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而參與糖尿病相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展；Li等[8]的研究證明了三七皂苷R1通過JNK通路減弱氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞功能障礙；Zhang等[9]的研究證明了JNK在成骨細(xì)胞中隨年齡增高而上調(diào)，且JNK的激活會阻止成骨細(xì)胞的膠原合成，并提示JNK抑制劑可能通過緩解成骨細(xì)胞功能下降而治療骨質(zhì)疏松癥。

SP600125是一種經(jīng)典的JNK抑制劑，在諸多疾病中具有良好的防治效果，如膽汁淤滯性肝損傷、糖尿病腎病等[10-11]。本研究似采用體外實(shí)驗(yàn)探究SP600125對成骨細(xì)胞的增殖與分化以及對破骨細(xì)胞功能的影響，旨在為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1主要試劑：SP600125購自美國MedChemexpress公司；α-MEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗和胎牛血清(FBS)均購自Gibco；鼠源RANKL和MCSF購自美國R&D Systems公司；CCK8試劑盒購自凱基生物技術(shù)有限公司；Qiagen RNeasy Mini RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄及SYBR熒光定量PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；抗JNK、抗c-Jun、抗p-c-Jun、抗p-JNK抗體、抗IκBa抗體、抗GAPDH抗體、抗兔二抗均購自美國CST公司；Alexa Fluor 647鬼筆環(huán)肽購自Abcam公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購自美國sigma公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.1.2細(xì)胞準(zhǔn)備：RAW264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞在含10 % FBS和1 %雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4～6周齡雌性C57BL/6/Bkl小鼠購自上海實(shí)驗(yàn)動物公司，從小鼠股骨和脛骨中分離出原代骨髓單核/巨噬細(xì)胞(BMMs)，并在添加30 ng/mL MCSF的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)[12]。成骨細(xì)胞分離自Wistar大鼠乳鼠。Wistar大鼠乳鼠購自斯貝福生物技術(shù)有限公司。以上細(xì)胞均在含5 % CO2的37 ℃、高濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要方法

1.2.1細(xì)胞活性測定：使用CCK8試劑盒參照說明書檢測三種細(xì)胞的增殖活性。將細(xì)胞接種于96孔板中，加入含不同濃度SP600125(0、2、4、6、8、10、20、30、40 μmmol/L)的α-MEM培養(yǎng)基，作用24 h后加入10 μl的CCK8試劑，孵育約2 h后在450 nm波長下檢測每孔細(xì)胞的吸光度并計(jì)算出增殖活性。

1.2.2鈣化結(jié)節(jié)染色：將成骨細(xì)胞接種至6孔板中，分別加入不同濃度SP600125(0、10、20 μmmol/L)和誘導(dǎo)劑β-甘油磷酸(0.5 mmol/L)、L-抗壞血酸(50 mg/L)和地塞米松(0.1 μmmol/L)[13]。待未經(jīng)SP600125處理的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)沙狀亮點(diǎn)時(shí)進(jìn)行染色。用多聚甲醛固定10 min,使用茜素紅S染色液在37 ℃下避光孵育60 min，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.3體外破骨細(xì)胞形成試驗(yàn)：將RAW264.7細(xì)胞以1.5×103每孔接種于96孔板中并加入含50 ng/mL RANKL的α-MEM培養(yǎng)基。分別使用不同濃度的SP600125(0、10、20 μmmol/L)處理細(xì)胞，當(dāng)未經(jīng)SP600125處理的RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞時(shí)，用4 %多聚甲醛固定細(xì)胞，用TRAP染色試劑盒參照說明書進(jìn)行染色。TRAP陽性細(xì)胞含3個(gè)以上細(xì)胞核，在高分辨率顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4骨吸收陷窩評估：在96孔板中將BMMs細(xì)胞以2.5×103每孔接種在牛骨片上，用不同濃度的SP600125(0、10、20 μmmol/L)、30 ng/mL MCSF和50 ng/mL RANKL培養(yǎng)細(xì)胞，直到未經(jīng)SP600125處理的細(xì)胞出現(xiàn)TRAP陽性破骨細(xì)胞。繼續(xù)孵育2 d后，通過機(jī)械攪動和超聲去除粘附在骨片上的細(xì)胞，在掃描電鏡下觀察骨吸收陷窩。

1.2.5F-肌動蛋白免疫熒光：采用F-肌動蛋白免疫熒光觀察破骨細(xì)胞的細(xì)胞膜。本研究使用不同濃度的SP600125(0、10、20 μmmol/L)、30 ng/mL MCSF和50 ng/mL RANKL處理BMMs細(xì)胞，當(dāng)BMMs細(xì)胞分化后分別用4 %多聚甲醛和0.1 % TritonX-100固定和通透細(xì)胞。使用Alexa Fluor 647鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，置于共聚焦顯微鏡下觀察F-肌動蛋白環(huán)的形成。

1.2.6RNA提取和RT-PCR：采用RT-PCR檢測破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)。將BMMs細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板，用不同濃度的SP600125(0、10、20 μmmol/L)、30 ng/mL MCSF和50 ng/mL RANKL進(jìn)行處理。同時(shí)使用不同濃度的SP600125(0、10、20 μmmol/L)處理分離的成骨細(xì)胞24 h。參照RNA提取試劑盒提取RNA，使用1 mg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 使用The SYBR Premix Ex Tag kit和ABI 7500 Sequencing Detection System進(jìn)行RT-PCR。PCR條件為95 ℃變性5 s, 60 ℃擴(kuò)增24 s，共40個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行3次。所用引物見表1。

表1 檢測破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞特異性基因所用的引物

1.2.7蛋白印跡：將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，分為RANKL組和RANKL+SP600125組，RANKL+SP600125組使用20 μmmol/L SP600125處理細(xì)胞24 h，繼而兩組細(xì)胞在50 ng/mL RANKL下分別作用0、5、10、20、30、60 min，提取蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液，超聲裂解2 min，4 ℃下?lián)u床震蕩1 h。在4 ℃下12 000 r/min,離心30 min，提取上清蛋白使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。使用約30～ 40 μg蛋白電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，使用5 %脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST清洗3次，二抗孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光法在發(fā)光儀下檢測條帶的深度和寬度。

1.2.8ROS檢測：將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，分組和處理同1.2.7，繼而使用ROS檢測試劑盒，用熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞中ROS的水平。用PBS清洗細(xì)胞3次，用10 μmmol/L DCFH-DA 于37 ℃孵育30 min，去除DCFH-DA，加入PBS,采用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長檢測ROS熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，收集數(shù)據(jù)并使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析(ANOVA)檢測組間差異,P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 SP600125對RAW264.7細(xì)胞、BMMs細(xì)胞和成骨細(xì)胞增殖活性的影響

采用不同濃度SP600125(0、2、4、6、8、10、20、30、40 μmmol/L)分別處理3種細(xì)胞以檢測SP600125對其增殖活性的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)SP600125濃度≤ 20 μmmol/L時(shí)，對3種細(xì)胞的增殖活性無顯著影響；而當(dāng)濃度≥30 μmmol/L時(shí)，細(xì)胞活性開始下降；且當(dāng)SP600125濃度為40 μmmol/L時(shí)，BMMs細(xì)胞的活力幾乎喪失(圖1)。因此，本研究在后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)選取SP600125濃度為10、20 μmmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 SP600125隨濃度(μmmol/L)增高對RAW264.7細(xì)胞(A)、BMMs細(xì)胞(B)和成骨細(xì)胞(C)活力的影響

2.2 SP600125對成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的影響

為了探究SP600125的成骨化作用，本研究對各組細(xì)胞進(jìn)行了鈣結(jié)節(jié)染色。結(jié)果顯示，分別經(jīng)10、20 μmmol/L SP600125處理的成骨細(xì)胞與未經(jīng)SP600125處理的成骨細(xì)胞中的鈣結(jié)節(jié)密度無顯著差異，表明SP600125對成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)的形成無顯著影響(圖2)。

圖2 不同濃度SP600125(10、20 μmmol/L)對成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的影響

2.3 SP600125對破骨細(xì)胞的分化和功能的影響

分別使用10、20 μmmol/L SP600125作用細(xì)胞并進(jìn)行TRAP染色、骨吸收陷窩評估及F-肌絲蛋白染色檢測其對破骨細(xì)胞分化的影響。TRAP染色結(jié)果顯示，未經(jīng)SP600125處理的細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞可發(fā)育為TRAP 陽性的成熟多核巨細(xì)胞。相反，SP600125處理的RAW264.7細(xì)胞分化受到抑制，其抑制呈現(xiàn)劑量依賴現(xiàn)象(圖3A)。表明SP600125可抑制RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。

圖3 不同濃度SP600125(10、20 μmmol/L)對破骨細(xì)胞分化和功能的影響

因此推測破骨細(xì)胞的骨吸收功能也可能受到SP600125的影響。骨吸收陷窩評估及F-肌絲蛋白染色結(jié)果顯示，未經(jīng)SP600125處理的BMMs細(xì)胞經(jīng)RANKL刺激可形成較多骨吸收陷窩，SP600125明顯減少骨吸收陷窩的數(shù)量(圖3B)。未經(jīng)SP600125處理的BMMs細(xì)胞F-actin環(huán)較多，而SP600125可顯著影響F-actin環(huán)的形成(圖3C)。因此，SP600125在體外抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。

2.4 SP600125對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的影響

為了探究SP600125對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的影響，本研究使用RT-PCR分別檢測了BMMs細(xì)胞中破骨細(xì)胞特異性基因NFATc1、c-fos、TRAP、CTR、cathepsin K和V-ATPase d2和成骨細(xì)胞特異性基因BMP-2、RUNX-2和OSX的mRNA水平。結(jié)果顯示，BMMs細(xì)胞經(jīng)RANKL刺激后，破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著增加，而SP600125以劑量依賴的方式抑制這些基因的激活(圖4)。這些數(shù)據(jù)表明，SP600125通過降低破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)來抑制破骨細(xì)胞的分化。而與之相反的是，SP600125不顯著改變成骨細(xì)胞特異性基因BMP-2、RUNX-2和OSX的表達(dá)(圖4)。

圖4 不同濃度SP600125對BMMs細(xì)胞中破骨細(xì)胞特異性基因NFATc1、c-fos、TRAP、CTR、cathepsin K和V-ATPase d2和成骨細(xì)胞特異性基因BMP-2、RUNX-2和OSX表達(dá)的影響

2.5 SP600125抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB通路、JNK通路的激活和氧化應(yīng)激水平

為了探究SP600125在體外抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制，本研究測定了JNK和c-Jun的磷酸化水平及IκBa蛋白水平。蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著RANKL處理時(shí)間的延長，JNK和c-Jun的磷酸化水平逐漸增高，提示JNK信號通路的激活(圖5B)。而SP600125抑制RANKL誘導(dǎo)的JNK通路的激活。此外，此次研究結(jié)果也顯示，RANKL處理可使RAW264.7細(xì)胞中IκBa蛋白水平隨時(shí)間下降，而SP600125處理之后分別在10、20、30、60 min時(shí)間點(diǎn)使IκBa蛋白表達(dá)水平升高(圖5A)。這些結(jié)果表明，SP600125通過抑制JNK和NF-κB通路抑制破骨細(xì)胞的分化。

研究[14]表明，氧化應(yīng)激是破骨細(xì)胞激活和骨丟失的關(guān)鍵因素，因此本研究檢測了RAW264.7細(xì)胞中ROS水平。結(jié)果顯示，隨著RANKL處理時(shí)間的延長，ROS熒光強(qiáng)度逐漸升高，而SP600125預(yù)先處理可使RANKL誘導(dǎo)的ROS水平升高得到緩解(圖5C)。

圖5 SP600125隨時(shí)間變化對RANKL誘導(dǎo)的IκBα水平(A)、JNK和c-Jun磷酸化水平(B)、ROS水平(C)的影響

3 討論

骨穩(wěn)態(tài)是由成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收協(xié)調(diào)來維持，過度激活的破骨細(xì)胞會破壞骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[15]。破骨細(xì)胞是骨質(zhì)疏松癥治療的重要靶點(diǎn)。雙膦酸鹽[16]、甲狀旁腺素相關(guān)肽[17]和抗RANKL單克隆抗體等藥物，可通過減弱骨吸收或刺激骨形成來治療骨質(zhì)疏松癥[18]，但它們有相當(dāng)廣泛的副作用[18]。例如，口服雙膦酸鹽會導(dǎo)致類流感癥狀、骨骼肌肉疼痛等癥狀[19]。雙膦酸鹽可導(dǎo)致急性腎功能衰竭[20]。甲狀旁腺素可刺激骨吸收從而限制新骨的積累[21]。羅莫珠單抗是一種骨硬化蛋白單克隆抗體，但該藥會增加心肌梗死、中風(fēng)等風(fēng)險(xiǎn)[22]。因此，開發(fā)副作用小、更有效地保留骨量的新藥物對改善骨質(zhì)疏松癥的治療策略勢在必行。

JNK是MAPK超家族的成員。在哺乳動物中，JNK由三個(gè)基因(JNK1、JNK2和JNK3)編碼，共有10個(gè)剪接變體[23]。c-Jun是JNK的直接下游因子，在信號刺激下，JNK可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的N端反式激活域絲氨酸63和73位點(diǎn)[24-26]。SP600125 是一種可滲透細(xì)胞、有效的可逆性JNK抑制劑[27-28]，在許多基礎(chǔ)研究[10-11,29]中已顯示出對多種疾病的緩解作用，如膽汁淤積性肝損傷、糖尿病腎病、神經(jīng)退行性疾病等。

鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞礦化的標(biāo)志，成骨細(xì)胞功能障礙造成的骨形成不足在骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[30]。鈣結(jié)節(jié)染色和RT-PCR結(jié)果顯示，SP600125對成骨細(xì)胞的增殖和分化無影響。JNK通路主要在病理?xiàng)l件下激活[24]。而目前鮮有證據(jù)證明JNK通路在生理情況下激活。本實(shí)驗(yàn)使用的成骨細(xì)胞取自Wistar大鼠乳鼠，其成骨細(xì)胞的活動是參與乳鼠骨形成的生理現(xiàn)象。而且，所取的成骨細(xì)胞也并未發(fā)生在骨質(zhì)疏松中所存在的功能障礙，因此本研究結(jié)果并不能得出SP600125不影響骨質(zhì)疏松中成骨細(xì)胞功能的結(jié)論。期待在未來能夠使用骨質(zhì)疏松的病理模型來進(jìn)一步探究SP600125對骨質(zhì)疏松中成骨細(xì)胞功能的影響。

破骨細(xì)胞是一種多核骨髓細(xì)胞，其過度激活可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[29]。TRAP染色、骨吸收陷窩評估、F-肌絲蛋白染色和RT-PCR結(jié)果顯示，SP600125能夠通過抑制破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)來抑制破骨細(xì)胞的分化和功能。

在破骨細(xì)胞分化過程中，RANKL與破骨前體細(xì)胞表面表達(dá)的RANK受體結(jié)合，并與TRAF相互作用。TRAF6通過核因子κB誘導(dǎo)激酶(NIK)和IκB激酶(IKK)激活NF-κB, 后者與IκB分離并迅速易位入核，而IκB進(jìn)一步分離成兩個(gè)蛋白，其中IκBα被降解。而且，IκBα降解是NF-κB激活過程中的一個(gè)代表性事件[15]。諸多研究[7,9]表明，JNK通路活化與骨質(zhì)疏松的發(fā)病具有密切的聯(lián)系。本次研究結(jié)果顯示，SP600125可通過抑制NF-κB和JNK通路來抑制破骨細(xì)胞的分化。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是許多疾病狀態(tài)的一個(gè)致病因素，包括骨質(zhì)疏松癥中骨密度的降低[31]。結(jié)果顯示，SP600125能夠通過抑制JNK通路進(jìn)而抑制NF-κB通路的活化和氧化應(yīng)激的發(fā)生。

綜上，JNK抑制劑SP600125可能通過抑制JNK通路進(jìn)而抑制NF-κB通路的活化和氧化應(yīng)激的發(fā)生，并阻止破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。本研究為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療和開發(fā)新的治療藥物提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。