葉恒 張衛(wèi)華 韓俊 張建業(yè) 蔣現(xiàn)永

武漢科技大學附屬漢陽醫(yī)院骨一科,湖北 武漢 430050

骨質(zhì)疏松癥是常見的骨骼疾病之一，主要特征為骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導致骨脆性增加、容易發(fā)生骨折[1-2]。目前，大部分研究[3]認為骨質(zhì)疏松癥與雌激素、遺傳、營養(yǎng)狀況及某些物理因素等引起的骨代謝失衡有關(guān)，而成骨細胞是骨代謝過程重要的功能細胞，其增殖和分化能力對于最終成骨量有決定性作用。微小RNA(micro RNAs，miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的單鏈RNA，可調(diào)控靶基因表達參與多種生理疾病的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報道[4]，miR-26a-5p通過靶向Wnt5a，可在體內(nèi)外促進炎癥來源人牙周膜干細胞的成骨分化。但miR-26a-5p在骨代謝中是否存在其他調(diào)控途徑尚不清楚。第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)作為一種磷酸酶，主要通過抑制絲氨酸/蘇氨酸及下游信號通路進行信號轉(zhuǎn)導，從而參與骨代謝過程[5]。本研究以成骨細胞MC3T3-E1為研究對象，驗證miR-26a-5p對PTEN的靶向作用，并分析miR-26a-5p對成骨細胞分化及基質(zhì)礦化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源：小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1由中國科學院上海細胞庫提供。

1.1.2主要試劑與儀器：胎牛血清(美國Gibco)，α-MEM培養(yǎng)基(美國Hyclone)，脂質(zhì)體2000試劑盒(美國Invitrogen)，miR-26a-5p模擬物(mimic)及陰性對照物無義序列、pcDNA3.1-PTEN及空載質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供，雙熒光素酶報告基因試劑盒、MTT粉末、RIPA試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、Trizol試劑(美國Sigma)，SYBR Green熒光染料試劑盒(日本TaKaRa)，堿性磷酸酶活性測定試劑盒、骨鈣素放射免疫分析試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，茜素紅染液(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(PTEN)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨橋蛋白(OPN)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3b(Gsk-3b)抗體、小鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam)。S1000型實時熒光定量PCR擴增儀(美國BioRad)，Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：用含有10 %胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，待細胞融合至80 %左右時，添加胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞，分為miR-26a-5p mimic組、miR-26a-5p mimic陰性對照(NC)組、pcDNA3.1-PTEN組、miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN組，參照脂質(zhì)體2000試劑盒說明書操作，將miR-26a-5p mimic及陰性對照物無義序列、pcDNA3.1-PTEN及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-26a-5p、PTEN mRNA水平：收集各組細胞，用Trizol試劑裂解細胞，提取細胞中總RNA，上微量分光光度計進行定量檢測后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再按著SYBR Green熒光染料試劑盒說明書進行熒光定量PCR擴增，擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，38個循環(huán)。記錄各組內(nèi)參U6、GAPDH和目的基因基本循環(huán)數(shù)(Ct)，采用2-△△Ct法計算miR-26a-5p、PTEN mRNA水平。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測：通過Target Scan軟件對miR-26a-5p與PTEN結(jié)合關(guān)系進行預(yù)測，獲得二者結(jié)合位點后，構(gòu)建PTEN-野生型(WT)3’UTR和PTEN-突變型(MUT)3’UTR，通過脂質(zhì)體2000試劑盒，將miR-26a-5p mimic及陰性對照物、PTEN-WT 3’UTR、PTEN-MUT 3’UTR共轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，通過雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組熒光強度。

1.2.4MTT檢測細胞增殖：取各組細胞以5×103個/孔接種于96孔板，正常培養(yǎng)48 h，加入含有20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，避光下培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜震蕩溶解6 min后，于酶標儀570 nm處檢測各孔吸光度值(A)，計算細胞增殖率[(A樣品-A空白)/A空白×100 %)。

1.2.5堿性磷酸酶活性測定：取各組細胞以2×104個/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后更換為含有成骨誘導劑(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-8mmol/L地塞米松和0.15 mmol/L抗壞血酸)的培養(yǎng)基，誘導7 d后，通過堿性磷酸酶活性測定試劑盒檢測細胞上清液中堿性磷酸酶活性。

1.2.6骨鈣素定量檢測分析：取各組細胞以2×104個/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后更換為含有礦化誘導劑(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸)的培養(yǎng)基，誘導21 d后，通過骨鈣素放射免疫分析試劑盒測定細胞上清液中骨鈣素含量。

1.2.7茜素紅染色觀察：取各組細胞以5×103個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后更換為含有礦化誘導劑(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸)的培養(yǎng)基，誘導21 d后，于70 %乙醇溶液中室溫固定1 h，加入10 %茜素紅染液，37 ℃下染色30 min，再加入10 %西吡氯胺，室溫放置10 min，于酶標儀570 nm處檢測各孔吸光度值(A)，計算礦化率。

1.2.8Western blot檢測細胞中相關(guān)蛋白表達：收集各組細胞，用RIPA試劑裂解細胞，提取細胞中總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度后，各組統(tǒng)一蛋白定量(70～100 μg)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5 %脫脂牛奶室溫下封閉2 h，分別添加兔抗ColⅠ(1∶2 000)、OPN(1∶5 000)、β-catenin(1∶1 000)、Gsk-3b抗體(1∶2 000)、小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，次日加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗工作液(1∶5 000)，37 ℃下孵育1 h，最后使用化學發(fā)光法顯色。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-26a-5p與PTEN靶向關(guān)系

如圖1，Target Scan軟件預(yù)測(圖1A)發(fā)現(xiàn)，miR-26a-5p與PTEN 3’UTR于2313-2320堿基處存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測(圖1B)顯示，與NC組比較，共轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimic和PTEN-WT 3’UTR質(zhì)粒細胞中熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)。實時熒光定量PCR(圖1C、1D)和Western blot檢測(圖1E)顯示，與NC組比較，miR-26a-5p mimic組miR-26a-5p水平升高，PTEN mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)，pcDNA3.1-PTEN組PTEN mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)；與miR-26a-5p mimic組比較，miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN組PTEN mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)。

圖1 miR-26a-5p與PTEN靶向關(guān)系

2.2 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞增殖的影響

如圖2，MTT檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，miR-26a-5p mimic組細胞增殖率升高，pcDNA3.1-PTEN組細胞增殖率降低(P<0.05)；與miR-26a-5p mimic組比較，miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN組細胞增殖率降低(P<0.05)。

圖2 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞增殖的影響

2.3 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞分化的影響

如圖3，堿性磷酸酶活性(圖3A)和Western blot檢測(圖3B)顯示，與NC組比較，miR-26a-5p mimic組堿性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN表達升高，pcDNA3.1-PTEN組堿性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN表達降低(P<0.05)；與miR-26a-5p mimic組比較，miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN組堿性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN表達降低(P<0.05)。

圖3 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞分化的影響

2.4 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞基質(zhì)礦化的影響

如圖4，骨鈣素定量(圖4A)和茜素紅染色檢測(圖4B)顯示，與NC組比較，miR-26a-5p mimic組骨鈣素和礦化率升高，pcDNA3.1-PTEN組骨鈣素和礦化率降低(P<0.05)；與miR-26a-5p mimic組比較，miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN組骨鈣素和礦化率降低(P<0.05)。

圖4 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞基質(zhì)礦化的影響

2.5 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

如圖5，Western blot檢測顯示，與NC組比較，miR-26a-5p mimic組β-catenin表達升高、Gsk-3b表達降低，pcDNA3.1-PTEN組β-catenin表達降低、Gsk-3b表達升高(P<0.05)；與miR-26a-5p mimic組比較，miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN組β-catenin表達降低、Gsk-3b表達升高(P<0.05)。

圖5 miR-26a-5p靶向PTEN對MC3T3-E1細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討論

成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡對于人體骨量起著重要的作用，而骨代謝紊亂是骨質(zhì)疏松癥的病理基礎(chǔ)[6]。大量研究顯示，miRNAs參與成骨細胞分化和基質(zhì)礦化過程：miR-455-3p靶向HIPK2抑制高糖誘導的成骨細胞凋亡，并促進其細胞增殖，可能與抑制STAT3信號通路有關(guān)[7]；miR-296可通過上調(diào)人成骨細胞hFOB1.19中Cbfal表達，促進成骨細胞分化[8]。miR-26a-5p是miR-26a的成熟鏈，miR-26a可廣泛表達于胚胎、肌肉、生殖器官等，具有豐富的生物學功能。Li等[9]研究顯示，miR-26a可抑制EZH2表達，增加成骨細胞，減少破骨細胞，保護激素誘導的股骨頭壞死。

本研究經(jīng)過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-26a-5p可靶向結(jié)合PTEN基因序列，Cai等[10]報道m(xù)iR-26a-5p與PTEN在糖尿病大鼠心肌損傷中也存在靶向關(guān)系。MC3T3-E1細胞轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimic后，PTEN表達下調(diào)，表明PTEN是miR-26a-5p的靶向基因。PTEN基因定位于染色體10q23.3，可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶活性參與病理生理過程[11]。Yin等[12]研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康人群，骨質(zhì)疏松癥患者miR-140-3p水平升高，PTEN表達降低，且miR-140-3p可靶向下調(diào)PTEN表達調(diào)控成骨/破骨細胞的分化。本研究分別將miR-26a-5p mimic、pcDNA3.1-PTEN轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞，miR-26a-5p mimic可促進細胞增殖、成骨分化及基質(zhì)礦化，增加成骨分化早期(堿性磷酸酶、ColⅠ)和晚期標志性蛋白(骨鈣素、OPN)表達，pcDNA3.1-PTEN可逆轉(zhuǎn)上述作用，表明miR-26a-5p可靶向下調(diào)PTEN，促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化。

骨代謝的平衡還受到多種信號通路的調(diào)控，其中Wnt信號通路無論是在成骨細胞的分化成熟，還是骨基質(zhì)礦化方面均有關(guān)鍵作用[13]。通過β-catenin作用激活基因轉(zhuǎn)錄是經(jīng)典的Wnt信號通路，β-catenin在成骨細胞中廣泛表達，可促進成骨細胞的分化和存活[14]。Parra-Torres等[15]研究表明，Wnt相關(guān)拮抗劑可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，從而參與骨代謝過程。本研究通過Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路表達，結(jié)果顯示miR-26a-5p過表達可提高MC3T3-E1細胞中β-catenin表達，但降低Gsk-3b表達，提高細胞中PTEN表達后，β-catenin表達降低，Gsk-3b表達升高。以上結(jié)果表明，miR-26a-5p靶向PTEN促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化，可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

綜上所述，miR-26a-5p通過負向調(diào)控PTEN表達，進而影響MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化，可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。miR-26a-5p作為成骨分化的正向調(diào)節(jié)分子可能是未來治療骨病的潛在治療靶點，但其對成骨分化的影響及在骨質(zhì)疏松癥中的作用機制還需要通過動物模型進一步闡明。