李曉婷 張悅瑤 王海豪 唐宏宇

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405

3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院三骨科，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的一種疾病[1]。如今全球OP患者人數(shù)已超過兩億，在常見病發(fā)病率排行中，OP位于第7位[2]。如何有效防治OP已成為國際上共同的公共衛(wèi)生問題[3]。

目前臨床上西醫(yī)治療OP的藥物包括維生素D、辛伐他汀等[4]，這些藥物在長期使用過程中，其副作用會(huì)逐漸顯露，如導(dǎo)致肌肉酸痛、惡心嘔吐、加重肝臟負(fù)擔(dān)、增加罹患乳腺癌等疾病的發(fā)生率等[5-7]。近年來中醫(yī)藥對(duì)OP的預(yù)防作用及對(duì)其病情發(fā)展的延緩作用已得到肯定，但具體起效的作用機(jī)制尚未完全明確[8]。針刺具有促進(jìn)骨形成、改善骨代謝等作用，但相關(guān)作用機(jī)制依舊值得深入探究[9]。

研究[10-11]顯示OPG/RANK/RANKL通路是骨代謝疾病產(chǎn)生的主要機(jī)制。故本文擬通過研究針刺對(duì)OP模型大鼠的生物力學(xué)性能和OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路的影響，進(jìn)而明確針刺防治OP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器：ZF-208凝膠成像(恒勤儀器設(shè)備有限公司，上海)；醫(yī)用離心機(jī)(Beckman公司，美國)；Dexa Pro-1型雙能X射線骨密度儀(GE公司，美國)；JS-Power300型電泳儀(迪奧生物科技有限公司，上海)；毫針(Hwato，0.25 mm×13 mm)，HANS-200A 電針儀(南京濟(jì)生)。

1.1.2藥品與試劑：阿侖膦酸鈉片(C14202011827，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20130085；規(guī)格：70 mg/片，Merck Sharp & Dohme Italia SPA)；OPG檢測(cè)試劑盒(百奧萊博科技有限公司，北京，批號(hào)：ZN2789)；血清Ca2+、P的ELISA試劑盒(百奧萊博科技有限公司，北京，批號(hào)分別為：ZN2746、ZN2731)；Western blotting試劑盒(批號(hào)：ED1963r)、羊抗鼠RANK多克隆抗體(批號(hào)：sc-374360，Santa Cruz Biotechnology)、羊抗鼠RANKL多克隆抗體(批號(hào)：sc-377079，Santa Cruz Biotechnology)、羊抗鼠OPG多克隆抗體(批號(hào)：sc-390518，Santa Cruz Biotechnology)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(批號(hào)：jx-1932，純度：>95 %)、羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(批號(hào)：sc-47724，Santa Cruz Biotechnology)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號(hào)：ED2571r)均購自廣州輝旺生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只6月齡的健康SD大鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量為160～200 克，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào)：SCXK(粵)2018-0034]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度為(22±2)℃、相對(duì)濕度50 %。本研究已獲廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1分組、造模與給藥：將大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組(40只)和假手術(shù)組(10只)。對(duì)其進(jìn)行為期4 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將手術(shù)組大鼠采用雙側(cè)卵巢摘除法建立OP模型[12-13]，術(shù)后正常飼養(yǎng)，2個(gè)月后開始藥物干預(yù)，連續(xù)給藥12周。將手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺低劑量組、針刺高劑量組以及阿侖膦酸鈉組，假手術(shù)組大鼠作為空白組；阿侖膦酸鈉組根據(jù)人與大鼠體表面積換算給予阿侖膦酸鈉片[7.35 mg/(kg·d)]灌胃治療；假手術(shù)組、模型組、針刺低劑量組和針刺高劑量組均給予灌胃等量的生理鹽水(給藥體積均為1 mL/100 g)；針刺低劑量組和針刺高劑量組按文獻(xiàn)[14]取穴，針刺低劑量組：暴露相關(guān)穴位(“腎俞穴”及“足三里穴”)，定位準(zhǔn)確后將毫針快速刺入，連接電針儀，疏密波，其中針刺低劑量組干預(yù)時(shí)長為15 min，針刺高劑量干預(yù)時(shí)長為30 min，每日1次。

1.2.2大鼠骨礦含量和骨密度檢測(cè)：末次給藥結(jié)束后24 h，注射戊巴比妥至大鼠腹腔，待其麻醉后，處死大鼠，取右側(cè)股骨和第4腰椎進(jìn)行研究，將右側(cè)股骨置于雙能X線骨密度儀器上檢測(cè)骨礦含量水平。另外，將右側(cè)股骨和腰椎置于X線骨密度儀器下掃描，計(jì)算骨密度含量。

1.2.3大鼠血清Ca2+、P和OPG、RANKL、RANK的水平：大鼠血清中Ca2+、P、OPG、RANKL、RANK等水平采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)。從大鼠的腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫放置1 h，然后以3 000 r/min離心20 min，分離血清。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4股骨生物力學(xué)性能檢測(cè)：采用三點(diǎn)彎曲測(cè)試評(píng)估。處死大鼠后，將完整的股骨從大鼠體內(nèi)取出，置于生物力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)上，以每分鐘2 mm的速度使實(shí)驗(yàn)機(jī)壓頭下壓，直到股骨受力面出現(xiàn)裂縫。進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，并測(cè)量股骨剛度等數(shù)值。

1.2.5大鼠骨組織中OPG、RANKL、RANK蛋白檢測(cè)：將大鼠處死，取右側(cè)股骨洗凈磨碎，加入裂解液后離心，提取待測(cè)股骨中各細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品(50 μg)加到 SDS-PAGE凝膠孔內(nèi)，20 μL/孔，用280 mA 電流轉(zhuǎn)膜1 h。取出PVDF膜，TBST洗3次×5 min，后將膜放入5 %的脫脂奶粉中，并于室溫條件下避光密閉儲(chǔ)存2 h。封閉結(jié)束后，將膜取出，再次用TBST 浸洗3次×5 min，加入OPG、RANKL、RANK的一抗稀釋液(稀釋度為1∶1 000)，4 ℃儲(chǔ)存過夜。加入二抗稀釋液(稀釋度為1∶200)，室溫孵育1h。顯色后，成像，并采用Image J v l.5.l軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行收集數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差具有同質(zhì)性時(shí)，多個(gè)組間比較采用單因素方差分析。若數(shù)據(jù)不能達(dá)到正態(tài)分布的要求或方差不具有同質(zhì)性時(shí)，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)OP大鼠骨組織中骨礦含量、血清Ca2+和血清P的影響

研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨組織中骨礦含量、血清Ca2+及血清P水平與明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，針刺的低劑量組、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中骨礦含量升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，針刺低劑量組大鼠血清Ca2+和P的表達(dá)無明顯升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，針刺高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠血清Ca2+和P的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠骨組織中骨礦含量和血清Ca2+、P水平測(cè)定結(jié)果

2.2 針刺對(duì)OP大鼠血清中OPG、RANKL和RANK水平的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清OPG表達(dá)明顯降低(P<0.01)，血清RANKL和RANK表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺的低劑量組、高劑量組和阿侖膦酸鈉陽性對(duì)照組大鼠血清OPG的表達(dá)較模型組升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠血清RANKL和RANK的表達(dá)降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；與阿侖膦酸鈉組比較，針刺高劑量組大鼠血清RANKL和RANK的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明針刺抑制骨質(zhì)疏松大鼠血清RANKL和RANK的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠血清OPG、RANKL和RANK水平的測(cè)定結(jié)果

2.3 針刺對(duì)OP大鼠右側(cè)股骨最大載荷、股骨剛度及彈性模量的影響

和假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨最大載荷、股骨剛度、彈性模量數(shù)值明顯降低(P<0.01)；和模型組比較，針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠股骨最大載荷、股骨剛度的數(shù)值升高明顯(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，表明經(jīng)過針刺干預(yù)后，療效明顯，而針刺低劑量組大鼠彈性模量的數(shù)值無明顯升高(P>0.05)，針刺高劑量組和阿侖膦酸鈉組升高明顯(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠生物力學(xué)性能測(cè)定結(jié)果

2.4 針刺對(duì)OP大鼠股骨和腰椎BMD含量的影響

和假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨和腰椎的BMD含量明顯降低(P<0.01)；和模型組比較，針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組大鼠股骨和腰椎的BMD含量升高明顯(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，表明經(jīng)過針刺干預(yù)后，療效明顯。見表4。

表4 各組大鼠骨密度測(cè)定結(jié)果

2.5 針刺對(duì)OP大鼠骨組織中OPG、RANKL和RANK蛋白的影響

和假手術(shù)組比較，模型組大鼠OPG蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，RANKL、RANK蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；和模型組比較，針刺低、高劑量組和阿侖膦酸鈉組的OPG蛋白表達(dá)升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，RANKL、RANK蛋白的表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01)；和阿侖膦酸鈉組比較，針刺高劑量組大鼠OPG蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而RANKL、RANK蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖1。

表5 各組大鼠骨組織中蛋白的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

圖1 各組大鼠骨組織中OPG、RANKL、RANK蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

關(guān)于OP，中醫(yī)并沒有相對(duì)應(yīng)的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“骨痿”的范疇[15]。主要病因有：腎虛精虧、脾虛導(dǎo)致氣血生化不足等[16]。在臨床中，OP的中醫(yī)治法以補(bǔ)腎健脾為主[17-21]。阿侖膦酸鈉是臨床治療OP的一線藥物[22]，故本研究以阿侖膦酸鈉為陽性藥對(duì)照，評(píng)價(jià)針刺治療OP的療效。有研究[23-24]表明“腎俞穴”“三陰交穴”“關(guān)元穴”及“足三里穴”是補(bǔ)腎健脾重要穴位，可增強(qiáng)骨密度，對(duì)于OP的生理病理有重要的影響，但具體作用機(jī)制未明確。

OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的成熟與分化過程中起到重要作用，該通路通過維持、調(diào)控OB與OC間動(dòng)態(tài)平衡影響OP的發(fā)生與發(fā)展[25-26]。在骨組織中，OB分泌的OPG為RANKL的高親和力誘餌樣受體，與RANKL有較強(qiáng)結(jié)合能力，故OPG可減少 RANKL與破骨細(xì)胞分化因子受體RANK的結(jié)合，影響RANK-RANKL途徑，使OC轉(zhuǎn)錄活化信號(hào)生成減少，從而抑制OC生成和成熟，并降低OC的活性[27]。若機(jī)體RANKL表達(dá)水平增高，OPG表達(dá)水平下降，則RANKL與RANK結(jié)合受到促進(jìn)，OB收到RANK-RANKL途徑產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄活化信號(hào)，刺激前破骨細(xì)胞分化為OC，從而促進(jìn)OC的形成、分化、成熟，進(jìn)而促進(jìn)骨吸收量的增加，最終導(dǎo)致骨組織損傷，以及OP的發(fā)生[28]。

本研究結(jié)果顯示，針刺可升高OP模型大鼠股骨骨礦、血清Ca2+和P含量，對(duì)股骨有明顯改善作用，表明針刺增加了OP模型大鼠的骨礦含量，減少了鈣、磷丟失，改善了生物力學(xué)性能；同時(shí)，針刺可以通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK途徑的傳導(dǎo)，對(duì)OC的增殖分化產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而降低OP模型大鼠的骨吸收量，減少Ca2+、P丟失，間接達(dá)到增加骨骼骨礦含量的效果，從而達(dá)到降低或延緩OP的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，針刺能夠通過上調(diào)OPG表達(dá)，阻礙RANKL-RANK途徑的表達(dá)，降低OC的生成，從而增加骨形成量，降低骨吸收量，進(jìn)而達(dá)到減少鈣磷丟失、提高骨骼骨礦含量、改善骨骼生物力學(xué)性能的效果。