周森 孫奇峰 蔣雷 張亞龍 楊宇恒 尹文哲

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，黑龍江 哈爾濱 150001

長(zhǎng)期失重環(huán)境導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)骨量丟失問(wèn)題，被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的誘導(dǎo)因素[1]，機(jī)體免疫機(jī)能的降低同樣困擾著人們進(jìn)一步探索外太空。近年來(lái)，我國(guó)在中藥防護(hù)骨量丟失方面做了探索性研究，已嶄露頭角。已有研究[2]表明，中藥物質(zhì)柚皮苷，可以增加骨量，促進(jìn)骨折愈合。另外，柚皮苷對(duì)小鼠免疫能力有調(diào)節(jié)作用[3]。骨免疫學(xué)[4]指出，免疫反應(yīng)同時(shí)影響著骨代謝，兩個(gè)系統(tǒng)之間存在相互作用。柚皮苷既調(diào)節(jié)骨代謝同時(shí)又具有調(diào)節(jié)免疫作用，而其中的免疫因子又參與骨代謝，那么，這兩者之間的共同細(xì)胞因子在骨代謝和免疫之間扮演何種角色？基于此，本研究擬對(duì)微重力下柚皮苷對(duì)T細(xì)胞干預(yù)下的成骨細(xì)胞增殖分化及其發(fā)生機(jī)制展開(kāi)進(jìn)一步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料：選取出生24 h內(nèi)的 SD 乳鼠(雌雄不限)10只，用于成骨細(xì)胞取材。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。原代大鼠T淋巴細(xì)胞購(gòu)于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；低糖DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、II型膠原酶、青-鏈霉素 (Solarbio公司)；胎牛血清(四季青,浙江天杭生物科技股份有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；茜素紅S染色液(0.2 %, pH 8.3，北京索萊寶科技有限公司)；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒增強(qiáng)型(碧云天生物技術(shù)有限公司)；柚皮苷(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)；Mouse Anti-GAPDH-Loading Control antibody、Mouse Anti-PCNA antibody、Mouse Anti-Erk2 antibody、 Goat Anti-Mouse IgG/HRP antibody(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；超敏ECL發(fā)光液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器：主要儀器: 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS，美國(guó)Equl 公司) ；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó) Heraeus 公司)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿(美國(guó)corning公司) ；Olympus IX70 光學(xué)倒置顯微鏡[Olympus(奧林巴斯)中國(guó)分公司]；電泳儀、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司) ；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng) (上海天能科技有限公司，Tanon GIS2010) ；圖像分析軟件(德國(guó) Leica 公司) ；酶標(biāo)儀(奧地利，AUTHOS HT2) 。

1.2 方法

1.2.1成骨細(xì)胞培養(yǎng)：于75 %乙醇浸泡5 min后，在無(wú)菌條件下取得SD乳鼠頭蓋骨，仔細(xì)刮除表面結(jié)締組織，反復(fù)用PBS沖洗，洗去血絲。置于含雙抗的PBS培養(yǎng)皿中，用眼科剪將骨片剪成約1 mm3的組織塊。轉(zhuǎn)移至離心管中，1 200 r/min，離心5 min棄去雜質(zhì)上清，加入2 mL無(wú)EDTA胰酶，37 ℃消化30 min，中間震蕩一次。棄上清，骨片中加入0.1 % II型膠原酶2 mL，37 ℃消化1.5 h，每隔約30 min震蕩一次，留取上清，1 000 r/min，離心10 min，重懸后接種。待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿瓶底80 %～90 %后，經(jīng)胰蛋白酶消化，以1∶2比例傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成骨細(xì)胞(第三代)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2原代成骨細(xì)胞鑒定

1.2.2.1堿性磷酸酶活性化學(xué)染色：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代成骨細(xì)胞，以4 %多聚甲醛固定液固定30 min，按堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行染色檢測(cè)。

1.2.2.2鈣化結(jié)節(jié)染色(茜素紅法)：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代成骨細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，培養(yǎng)板用PBS沖洗3次，以4 %多聚甲醛固定液固定30 min，蒸餾水沖洗3次，37 ℃下0.2 %茜素紅[茜素紅-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色30 min，蒸餾水沖洗。在低倍鏡視野(×40)下進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)觀察。

1.2.3柚皮苷溶液配制：稱量10 mg柚皮苷粉末，用0.085 mL DMSO溶液充分溶解后，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，即可配得濃度為0.2 mol/L的柚皮苷母液。通過(guò)完全培養(yǎng)基稀釋母液分別得到2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7mol/L 梯度濃度的干預(yù)液。所有干預(yù)液用0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4藥物濃度確定

1.2.4.1CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第三代成骨細(xì)胞，消化后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，以5×103個(gè)/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL。分為干預(yù)組與對(duì)照組，干預(yù)組分別加入梯度濃度的柚皮苷干預(yù)液10 μL(終濃度分別為2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L)，對(duì)照組加入等劑量不含血清的培養(yǎng)基溶液。孵育24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，計(jì)算出細(xì)胞增值率。

1.2.4.2堿性磷酸酶活性測(cè)定和Western blot檢測(cè)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代成骨細(xì)胞，接種置6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至皿底的80 % ～ 90 %時(shí)，干預(yù)組分別加入梯度濃度的柚皮苷干預(yù)液(終濃度分別為2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L)，對(duì)照組加入等劑量不含血清的培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組ALP細(xì)胞活力。加入5×上樣緩沖液后沸水煮10 min，使用80 V恒壓待樣品進(jìn)入分離膠后加壓至120 V恒壓電泳全程后轉(zhuǎn)膜，加入含5 %脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫封閉1 h。加入1∶1 000 稀釋的抗小鼠 PCNA(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST 清洗膜 3 次。加入 1∶10 000稀釋的羊抗鼠二抗孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，運(yùn)用超敏ECL發(fā)光液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司)檢測(cè)不同樣品蛋白表達(dá)。

1.2.5失重模型的建立:采用RCSS細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以30 r/min均勻培養(yǎng)48 h，期間隨時(shí)觀察細(xì)胞，若有氣泡產(chǎn)生應(yīng)及時(shí)清除。將對(duì)照組置于培養(yǎng)瓶中，在正常重力下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.6成骨細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞直接共培養(yǎng)

1.2.6.1分組：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代成骨細(xì)胞隨機(jī)分成正常重力不加藥組、正常重力加藥組、失重不加藥組、失重加藥組。待細(xì)胞鋪滿至瓶底，將T細(xì)胞以5×105個(gè)/mL濃度與其直接共培養(yǎng)。加藥組加入柚皮苷干預(yù)液。失重組置于回轉(zhuǎn)器內(nèi)。

1.2.6.2ALP堿性磷酸酶活性測(cè)定：四組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白，通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，應(yīng)用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組ALP細(xì)胞活力。

1.2.6.3Western blot檢測(cè)：失重組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗后，吸盡殘余液體，加入適量RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。按照說(shuō)明書使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度，加上樣緩沖液，在100 ℃下變性處理蛋白10 min。制膠完成后，按總蛋白量20 μg上樣。使用80 V恒壓待樣品進(jìn)入分離膠后加壓至120 V恒壓電泳至完成電泳，20 V半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜20 min后，使用5 %脫脂奶粉封閉 1 h。然后敷目的一抗 ，4 ℃冰箱保存過(guò)夜，次日使用TBST洗膜3次，每次10 min，室溫下二抗孵育2 h，再使用TBST洗膜3次，每次10 min ，顯影后采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t-test進(jìn)行分析。以P<0.05 判斷為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代成骨細(xì)胞鑒定

2.1.1堿性磷酸酶染色：可見(jiàn)大量染色陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)顆粒染色呈藍(lán)黑色顆粒，塊狀深染顆粒，見(jiàn)圖1。

圖1 成骨細(xì)胞(第3代)堿性磷酸酶染色(× 40)

2.1.2茜素紅染色：細(xì)胞匯合時(shí)均呈多層重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞局部堆集成灶狀，形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色改結(jié)節(jié)染成橘紅色，見(jiàn)圖2。

圖2 成骨細(xì)胞(第3代)茜素紅染色(× 40)

2.2 藥物濃度確定

2.2.1CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖：不同梯度濃度柚皮苷干預(yù)液組細(xì)胞增殖率均明顯升高(2×10-4、2×10-6、2×10-7、2×10-8mol/L組，P<0.05 ; 2×10-5mol/L組，P<0.01)。其中2×10-7mol/L組細(xì)胞增殖率最高。見(jiàn)圖3。

圖3 各濃度柚皮苷干預(yù)液對(duì)成骨細(xì)胞增殖率的影響

2.2.2ALP活力測(cè)定：不同梯度濃度柚皮苷干預(yù)液組ALP活力值均高于對(duì)照組(2×10-5、2×10-6、2×10-8mol/L組,P<0.05; 2×10-4、2×10-7mol/L組，P<0.01)。其中2×10-7mol/L組ALP活力值最高。見(jiàn)圖4。

圖4 各濃度柚皮苷干預(yù)液對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響

2.2.3各組PCNA蛋白水平表達(dá)：成骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)各組濃度梯度柚皮苷干預(yù)液干預(yù)24 h后，通過(guò)Western blot檢測(cè)蛋白PCNA表達(dá)情況，柚皮苷干預(yù)液可顯著上調(diào)PCNA蛋白表達(dá)(P<0.01)。其中2×10-7mol/L組的表達(dá)最高。見(jiàn)圖5。結(jié)合CCK-8細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)與ALP活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，在2×10-7mol/L濃度時(shí)，柚皮苷干預(yù)液對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的影響最高，在后續(xù)研究中將參照這個(gè)濃度進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

圖5 各組PCNA蛋白表達(dá)電泳圖及條帶量化結(jié)果

2.3 微重力下成骨細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞直接共培養(yǎng)

2.3.1ALP活性：加藥組ALP活性顯著高于未加藥干預(yù)組(正常重力不加藥組與正常重力加藥組相比、失重不加藥組與失重加藥組相比，P<0.01)；失重組ALP活性顯著低于正常重力組(正常重力不加藥組與失重不加藥組相比、正常重力加藥組與失重加藥組相比，P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組ALP活性表達(dá)

2.3.2失重組測(cè)定PCNA蛋白表達(dá)：加藥組顯著高于未加藥組(P<0.01)，柚皮苷促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞干預(yù)下的成骨細(xì)胞增殖。進(jìn)一步測(cè)定通路蛋白ERK2表達(dá)，加藥組顯著高于未加藥組(P<0.01)。表明ERK2蛋白參與此過(guò)程。見(jiàn)圖7。

圖7 失重組PCNA、ERK2蛋白表達(dá)電泳圖及條帶量化結(jié)果

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性骨病，其特征是骨量、骨質(zhì)量和微結(jié)構(gòu)退化[5]。由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同參與的骨重建失衡導(dǎo)致了這種病理性骨病[6]。與化學(xué)合成的藥物相比，中醫(yī)藥用于防治骨質(zhì)疏松癥因具有不良反應(yīng)少、適合長(zhǎng)期服用和治療效果穩(wěn)定的特點(diǎn)，逐漸成為一種主流治療手段[7]。柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要作用成分，可以有效促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖并促使其向成骨細(xì)胞分化[8]。柚皮苷的干預(yù)有效促進(jìn)了已分化成骨細(xì)胞的正常功能，表現(xiàn)為提高骨鈣素的表達(dá)[9]。有報(bào)道[10]表明通過(guò)檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同濃度柚皮苷作用下的增殖分化情況，在一定濃度范圍內(nèi)，促進(jìn)成骨相關(guān)的作用和柚皮苷濃度呈計(jì)量依賴關(guān)系。不同濃度梯度柚皮苷干預(yù)液作用成骨細(xì)胞后，通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、ALP活力檢測(cè)觀察細(xì)胞分化情況。此外，還進(jìn)行了PCNA蛋白表達(dá)分析，以證實(shí)柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響[11]。本課題組認(rèn)為柚皮苷干預(yù)液在2×10-7mol/L濃度時(shí)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化作用最佳。

骨免疫學(xué)說(shuō)[4]指出，在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，免疫系統(tǒng)參與病理和慢性病的形成。有報(bào)道[12]提出，T淋巴細(xì)胞可以刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。同樣，柚皮苷對(duì)免疫系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)都有一定的保護(hù)或增強(qiáng)作用[3]，能夠提高T淋巴細(xì)胞亞群 CD3、CD4、IL-2、TNF-α水平，而這其中一些又是骨代謝因子。柚皮苷既調(diào)節(jié)骨代謝同時(shí)又具有調(diào)節(jié)免疫的作用，而其中的免疫因子又參與了骨代謝[13]。在骨代謝方面，ERK1/2蛋白通路與IL-6、IL-2、OPG 等免疫因子有關(guān)[5,14]。因此，本研究旨在探討兩者之間的共同細(xì)胞因子在骨代謝和免疫之間的關(guān)聯(lián)及其作用。

使用Synthecon RCCS三度空間微重力培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建細(xì)胞微重力環(huán)境[15]，通過(guò)分組觀察微重力和藥物對(duì)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)下的成骨細(xì)胞增殖分化的影響。在正常重力下，對(duì)比藥物對(duì)成骨細(xì)胞影響，結(jié)果表明柚皮苷干預(yù)液可以顯著提高成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，提高成骨細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化；在柚皮苷干預(yù)下，對(duì)比重力對(duì)成骨細(xì)胞影響。在失重狀態(tài)下，其可以明顯降低成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，抑制成骨細(xì)胞分化。進(jìn)一步觀察失重組通路蛋白ERK2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)柚皮苷干預(yù)組的ERK2表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。說(shuō)明在微重力下，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)成骨細(xì)胞在柚皮苷干預(yù)下產(chǎn)生的增殖分化可能與ERK2通路蛋白激活有關(guān)。