劉合棟 任茂賢 李楊 蔣文凱 周志 楊民

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001

隨著社會(huì)人口老齡化的不斷發(fā)展，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率日益升高[1]。研究[2]表明，氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中占有重要地位?；钚匝踔饕删€粒體產(chǎn)生，過量的活性氧在降低成骨細(xì)胞功能的同時(shí)可以激活破骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨重建失衡從而引起骨質(zhì)疏松。此外，活性氧增加可導(dǎo)致線粒體膜電位降低，引起細(xì)胞凋亡[3]。因此，保護(hù)成骨細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷對于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。

褪黑素是一種由松果體分泌、受下丘腦調(diào)節(jié)的無毒性吲哚胺，主要調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律，同時(shí)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等功能[4]。有研究[5]表明，在非腫瘤細(xì)胞中褪黑素通過激活SIRT1發(fā)揮作用，而SIRT1的作用靶點(diǎn)之一是p66SHC，SIRT1上調(diào)可以降低p66SHC的表達(dá)[6]。同時(shí)，p66SHC可以將氧化信號轉(zhuǎn)變成活性氧，并促進(jìn)線粒體氧化信號轉(zhuǎn)變成凋亡信號[7]。由此推測褪黑素可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/p66SHC信號通路來抑制氧化應(yīng)激引起的成骨細(xì)胞的凋亡。因此，本研究擬使用體外H2O2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型來探討褪黑素對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗均購于美國Gibco公司；褪黑素(melatonin，MT)、CCK8試劑、BCIP/NBT堿性磷酸脂酶顯色試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、0.2 %茜素紅、十六烷基吡啶均購于索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；凋亡檢測試劑盒購買于貝博生物科技有限公司；抗體SIRT1、p66SHC、Bax、Bcl2、BMP2、RUNX2、β-actin購買于Affinity公司；手術(shù)器械由皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科提供。礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基由F12-DMEM完全培養(yǎng)基加入10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C配置而成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1成骨細(xì)胞的分離、純化及鑒定：取24 h內(nèi)新生SD大鼠乳鼠浸泡于75 %乙醇中20 min，移入無菌操作臺(tái)，使用眼科剪和眼科鑷分離顱骨，刮去骨膜及骨縫間結(jié)締組織并用含雙抗的PBS沖洗，直至骨塊變白。將骨塊剪成1 mm×1 mm大小骨片，加入5 mL 0.25 %胰酶消化10 min，棄胰酶，加入5 mL 0.5 % I型膠原酶震蕩消化20 min，棄消化液后再次加入5 mL 0.5 % I型膠原酶在37 ℃恒溫下消化90 min。消化完畢后用等量含血清的F12-DMEM培養(yǎng)基終止消化，無菌篩網(wǎng)過濾，將碎骨片接種于T25培養(yǎng)瓶中倒置培養(yǎng)，4 h后正置培養(yǎng)瓶。成骨細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d、21 d后，按照試劑盒說明書分別進(jìn)行ALP和茜素紅染色，以鑒定原代成骨細(xì)胞是否提取成功。

1.2.2氧化應(yīng)激模型的建立：將第三代成骨細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后更換成含100、200、400、800 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2、3、4、5、6 h，結(jié)束后每孔加入10 μL CCK8 試劑并孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。依據(jù)說明書計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：將第三代成骨細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，將細(xì)胞分為四組：對照組、H2O2組(400 μmol/L H2O2作用4 h)、MT組(100 μmol/L褪黑素預(yù)處理24 h然后用400 μmol/L H2O2作用4 h)、EX527組(MT預(yù)處理前用10 μmol/L EX527預(yù)處理2 h)。結(jié)束后收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書測定SOD活性及MDA含量，同時(shí)將四組細(xì)胞孵育DCFH-DA探針，熒光顯微鏡記錄四組細(xì)胞圖像并測定ROS熒光強(qiáng)度。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：細(xì)胞經(jīng)不同干預(yù)措施處理后，使用凋亡檢測試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行FITC和PI染色，結(jié)束后經(jīng)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5ALP及茜素紅染色：細(xì)胞經(jīng)不同干預(yù)措施干預(yù)7 d、21 d后，按照試劑盒說明書分別行ALP及茜素紅染色。同時(shí)，用ALP活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞ALP活性，用十六烷基吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)，用酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度。

1.2.6Western Blot檢測蛋白水平：用RIPA裂解液收集各組細(xì)胞，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度并計(jì)算30 μg蛋白所需上樣量。樣本經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離不同分子量蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5 %BSA封閉2 h，然后將膜置于含有SIRT1(1∶1 000)、p66SHC(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)、BMP2(1∶1 000)、RUNX2(1∶1 000)、β-actin(1∶500)的抗體盒中，4 ℃搖床孵育過夜。次日將膜用TBST洗凈并放入對應(yīng)二抗中孵育2 h。孵育完成后用TBST洗凈并用ECL發(fā)光液顯影，使用Image J測定灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的提取與鑒定

如圖1所示，骨塊貼壁3 d后，倒置顯微鏡下可見骨塊蓬松，細(xì)胞零星的從骨塊邊緣爬出，呈飽滿長梭形(圖1B)，7 d后鋪滿整個(gè)瓶底(圖1C)。ALP染色顯示細(xì)胞被染成藍(lán)紫色(圖1 D)，茜素紅染色視野中可見數(shù)量不一、大小不等的橘紅色圓形鈣結(jié)節(jié)(圖1E)，提示原代成骨細(xì)胞提取成功。

圖1 原代成骨細(xì)胞的提取與鑒定

2.2 H2O2對成骨細(xì)胞增殖的影響及氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

如圖2A所示，成骨細(xì)胞存活率隨著H2O2濃度的升高和作用時(shí)間的延長而逐漸下降，在400 μmol/L濃度下作用4 h存活率為52 %，因此采用此濃度與時(shí)間建立氧化應(yīng)激模型。經(jīng)H2O2、褪黑素、EX527處理后，各組細(xì)胞ROS含量、SOD活性、MDA含量如圖2B～圖2E所示，結(jié)果表明H2O2處理后ROS升高，熒光顯著增強(qiáng)，細(xì)胞腫脹變圓，SOD活性降低，MDA含量升高，表明H2O2處理后成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高。褪黑素處理緩解了H2O2對成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，而EX527能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素對H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

圖2 H2O2對成骨細(xì)胞增殖的影響及氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

2.3 各組細(xì)胞ALP活性、礦化能力及凋亡的變化

細(xì)胞經(jīng)H2O2、褪黑素、EX527處理后，成骨細(xì)胞ALP及茜素紅染色結(jié)果如圖3A、3B所示，定量分析結(jié)果如圖3C、3D所示，凋亡率如圖3E所示。結(jié)果表明H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，成骨細(xì)胞ALP活性及礦化能力下降，凋亡率升高；褪黑素預(yù)處理能夠緩解H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，使成骨細(xì)胞ALP活性及礦化功能增強(qiáng)，凋亡率降低；而EX527能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素的上述功能。

圖3 各處理因素對成骨細(xì)胞ALP活性、礦化能力及凋亡的影響

2.4 不同處理措施干預(yù)后對細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞經(jīng)不同處理措施干預(yù)后，蛋白表達(dá)如圖4所示。結(jié)果表明，H2O2處理后成骨細(xì)胞BMP2、RUNX2、Bcl2、SIRT1表達(dá)降低，Bax、p66SHC表達(dá)升高。褪黑素處理能夠緩解上述蛋白表達(dá)的變化。而SIRT1抑制劑EX527能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素的上述功能。

圖4 各處理措施對成骨細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨重建由成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收來維持，當(dāng)成骨細(xì)胞的骨形成不足以彌補(bǔ)破骨細(xì)胞的骨吸收時(shí)就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[8]。本研究中，成骨細(xì)胞經(jīng)褪黑素預(yù)處理后與H2O2組比增強(qiáng)了ALP活性、礦化功能，降低了ROS、MDA含量，增強(qiáng)了SOD活性，減少了凋亡率，增加了BMP2、RUNX2、Bcl2、SIRT1蛋白的表達(dá)，降低了Bax、p66SHC蛋白的表達(dá)，SIRT1抑制劑EX527能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素的上述作用，表明褪黑素通過調(diào)節(jié)SIRT1/p66SHC通路來抑制H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷并促進(jìn)成骨。

H2O2作為ROS主要成分之一，由于具有相對穩(wěn)定性和長時(shí)間不帶電等特性被廣泛用于誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷模型[9]。本研究顯示，H2O2處理后成骨細(xì)胞活性降低，細(xì)胞腫脹變圓，ROS含量增加，表明細(xì)胞趨于凋亡。過量產(chǎn)生ROS將激活氧化應(yīng)激并破壞脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，引起脂質(zhì)過氧化[10]。其產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)NF-κB通路、MAPKs通路、PKC通路來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。同時(shí)，ROS的大量產(chǎn)生將消耗細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)，引起抗氧化酶活性降低。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后ROS含量、MDA含量增加，SOD活性降低，細(xì)胞凋亡增加，表明H2O2處理成功誘導(dǎo)了成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

本研究中，褪黑素通過SIRT1/p66SHC通路抑制氧化應(yīng)激并促進(jìn)成骨，這與Chen等[12]的研究結(jié)果相似，其研究顯示褪黑素通過上調(diào)SIRT1抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化從而促進(jìn)成骨。Zhou等[13]研究表明褪黑素通過調(diào)節(jié)SIRT3/SOD2通路抑制線粒體氧化應(yīng)激增加OVX大鼠假體周圍骨量。最近研究[14]表明，褪黑素激活SIRT1/PGC1α/SIRT3通路保護(hù)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，大腦p66SHC基因缺失的小鼠顯示出SIRT3活性增強(qiáng)[15]。由此筆者推測褪黑素可能通過SIRT1/p66SHC軸調(diào)節(jié)SIRT3/SOD2軸發(fā)揮抗氧化應(yīng)激功能。此外，體內(nèi)研究[16]發(fā)現(xiàn)褪黑素MT1受體缺陷小鼠骨量正常，而MT2受體缺陷的小鼠表現(xiàn)出低骨量，表明褪黑素主要通過MT2受體調(diào)節(jié)骨量。褪黑素還能通過改善炎癥因子的表達(dá)增加OVX大鼠的骨密度[17]。體外研究[18]表明褪黑素能夠上調(diào)神經(jīng)肽Y和神經(jīng)肽Y受體的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與遷移，從而促進(jìn)骨折愈合。這些結(jié)果表明褪黑素能夠通過受體介導(dǎo)和非受體依賴(抗氧化和抗炎作用)作用機(jī)制來預(yù)防骨降解，促進(jìn)骨形成。

SIRT1是一種NAD+依賴的III類組蛋白脫乙酰酶，通過對組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等多種底物進(jìn)行去乙?；瘉碚{(diào)節(jié)細(xì)胞周期、炎癥、凋亡、自噬等生物過程[19]。研究[6]表明，在內(nèi)皮細(xì)胞中，SIRT1過表達(dá)能夠使組蛋白H3發(fā)生去乙?；?，減少乙酰化組蛋白H3與p66SHC啟動(dòng)子的結(jié)合，從而降低p66SHC的轉(zhuǎn)錄。p66SHC是shcA基因家族中的一個(gè)亞型，在誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞感知氧化應(yīng)激時(shí)，p66SHC從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體并氧化細(xì)胞色素C，催化氧還原為H2O2，導(dǎo)致ROS升高[20]。升高的ROS觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放，引起線粒體腫脹，線粒體外膜破裂，電子傳遞鏈蛋白復(fù)合體活性下降，并釋放促凋亡因子引起細(xì)胞凋亡[21]。本研究中，褪黑素上調(diào)SIRT1的同時(shí)降低了p66SHC的表達(dá)，同時(shí)SOD活性增強(qiáng)，ROS含量、MDA含量降低，Bcl2表達(dá)升高而Bax表達(dá)降低；而SIRT1抑制劑EX527能夠抑制褪黑素的上述作用。這些結(jié)果提示褪黑素通過SIRT1/p66SHC通路抑制H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，褪黑素可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/p66SHC通路來抑制H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷并促進(jìn)成骨。但本研究尚需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其機(jī)制。