李亮亮，王繼雯，劉德海，甄靜，慕琦，李磊，雷高，楊文玲

(河南省科學院生物研究所有限責任公司/河南省微生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450008)

植物內生真菌是指生活史的某一段時期定殖在植物體內且不會引起寄主植物明顯病害的一類真菌[1，2]。 研究表明幾乎所有植物體內都有內生真菌的存在[3-5]。 由于植物內生真菌代謝產物中存在豐富多樣的活性物質包括植物生長調節(jié)劑類、抗生素類、抗腫瘤活性類等[6]，在農業(yè)、醫(yī)藥方面具有重要應用價值。 因此植物內生真菌已成為發(fā)現高效、低毒的天然活性物質的重要生防資源。

植物內生真菌種類繁多，對其多樣性研究一般采用組織分離法。 徐祥林等[7]從羅漢果植株中分離到150 株內生真菌，經鑒定大都屬于子囊菌門。 施文廣等[8]從檀香紫檀的不同組織中分離到337 株內生真菌，其中根部99 株、莖部66株、葉部172 株，結合形態(tài)學和ITS-rDNA 序列分析，發(fā)現這些真菌主要隸屬于15 個屬。 由于自然界中僅有少量微生物可以進行體外培養(yǎng)[9]，所以通過組織分離法研究植物內生真菌多樣性具有較大局限性。 隨著近年來高通量測序技術的發(fā)展，植物內生真菌多樣性的研究進入了一個新的發(fā)展階段。 與傳統的組織分離法相比，高通量測序技術具有測序基數大、測序深度廣等優(yōu)點[10]，可提供更加全面準確的植物內生真菌多樣性信息。 目前高通量測序技術已在刺槐[11]、杜仲[12]、白及[13]、鐵皮石斛[14]等多種植物內生真菌多樣性的研究中得到應用。

花生(Arachis hypogaeaLinn.)是我國大面積種植的油料作用，具有重要的經濟價值。 目前關于花生內生真菌種群多樣性的高通量測序研究還未見報道。 因此本試驗利用高通量測序技術研究盛花期健康花生植株根、莖、葉、花不同部位內生真菌的種群多樣性及其生態(tài)功能群結構，以期為進一步利用花生內生真菌資源奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 花生樣品采集

花生植株樣本于2020年7月30 日采自河南省汝南縣三橋鎮(zhèn)(114°21′51′′E，32°49′43′′N)。選擇3 個樣方，每個樣方隨機選取5 株盛花期健康植株，保持根系完整，立即放入冰盒中帶回實驗室。 用大量無菌水對花生植株表面泥土進行沖洗后，再用無菌剪刀將不同樣品按根、莖、葉、花組織分開。 每個樣方5 株花生不同組織的混合樣品作為一個生物學重復，共設3 個重復，一共12 個樣品，分別為根(R):R1、R2、R3；莖(S):S1、S2、S3；葉(L):L1、L2、L3；花(F):F1、F2、F3。

1.2 花生樣品表面消毒

首先用無菌水將花生不同組織樣本沖洗30 s，隨后用75%乙醇沖洗2 min，接著置于2.5%次氯酸鈉溶液(含0.1%吐溫80)中浸泡5 min，再用無菌水沖洗3 次。 取最后一次沖洗液經平板涂布檢測無菌后進行后續(xù)試驗。

1.3 花生樣品基因組DNA 提取及PCR 擴增

使用FastDNA Spin Kit(MP Biomedicals)試劑盒提取花生不同組織總DNA。 用NanoDrop 2000檢測DNA 純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性。 DNA 樣品經檢測合格后進行PCR擴增和高通量測序。 PCR 擴增引物為ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3′；ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。 反應體系(20 μL):10×FastPfuBuffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，rTaqPolymerase 0.2 μL，DNA 模板(10 ng/μL) 1 μL，BSA 0.2 μL，補ddH2O 至20 μL。 擴增條件:95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共27 個循環(huán)；72℃延伸10 min。 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，通過Illumina公司MiSeq 測序平臺進行高通量測序。

1.4 數據處理

基于有效序列，利用Uparse 軟件(http:/ /www.drive5.com/uparse/)在97%相似水平下進行OTU 聚類[15]。 為了得到每個OTU 對應的物種分類信息，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，并分別在Kingdom(界)、Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)統計各樣本的群落物種組成，選用的比對數據庫為真菌ITS 數據庫UNITE(https:/ /unite.ut.ee/)。 利用Mothur(https:/ /mothur.org/wiki/Down)和Qiime(http:/ /qiime.org/install/index.html)軟件計算花生不同器官內生真菌基于OTU 分類水平的Alpha 多樣性指數，主要包括反映群落豐富度的Ace 指數，反映群落多樣性的Shannon 指數和Simpson 指數以及反映群落覆蓋度的指數Coverage[16]。 為研究花生不同組織內生真菌群落結構的相似性或差異關系，對樣本群落進行聚類分析和主成分分析。 最后通過FUNGuild 軟件按照對環(huán)境資源的吸收利用上采取的方式差異將花生內生真菌進行生態(tài)功能群分類。

2 結果與分析

2.1 花生不同組織內生真菌測序統計及其多樣性分析

經高通量測序共從花生不同組織得到有效序列763200 條，其中根部186492 條，莖部157447條，葉部199978 條，花部219283 條。 在97%相似水平下共獲得的OTU 數量為308，根部、莖部、葉部和花部的OTU 數量分別為208、126、84 和77(表1)，表明花生內生真菌具有豐富的種群多樣性。 從圖1 可以看出，花生不同組織共有的OTU數是35，根部、莖部、葉部和花部獨有的OTU 數分別是120、52、23 和20。 根部和莖部共有的OTU數目最多(70)，說明兩個組織含有的相似或相同物種較多。

圖1 花生不同組織內生真菌Venn 分析

表1 花生不同組織內生真菌Alpha 多樣性指數

基于有效序列和OTU 水平分析花生不同組織內生真菌的種群多樣性和豐富度，由表1 可知，根部內生真菌的多樣性和豐富度均最高，莖部和葉部次之，花部最低。 對序列進行隨機抽樣，以抽到的序列數與其對應的多樣性指數構建稀釋曲線。 12 個樣本的Sobs 稀釋曲線(圖2)隨著抽樣讀取數的增加趨向平坦，說明測序數據量合理。Shannon 稀釋曲線(圖3)表明隨著抽樣讀取數的增加，12 個樣本的Shannon 指數近似一條直線，說明本次測序數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息。

圖2 Sobs 稀釋曲線

圖3 Shannon 稀釋曲線

2.2 花生不同組織內生真菌群落結構及豐度分析

種群分類學分析表明，花生內生真菌一共包括9 個門，25 個綱，51 個目，107 個科，155 個屬。花生根、莖、葉、花不同組織包含的內生真菌分類階層如表2 所示，其中根部內生真菌種群多樣性最為豐富，莖部和花部次之，葉部最低。

表2 花生內生真菌物種分類階層統計

在門、綱和屬分類水平上對花生不同組織內生真菌群落和豐度進行分析。 將樣本中相對豐度＞5.00%的菌群定義為優(yōu)勢菌群。

花生根部內生真菌覆蓋9 個門，其中子囊菌門(Ascomycota)豐度最高，達到65.82%，其次為擔子菌門(Basidiomycota)，豐度為25.28%，另有未分類真菌門6.59%。 包含23 個綱，優(yōu)勢綱為糞殼 菌 綱( Sordariomycetes，28. 71%)、 銀 耳 綱(Tremellomycetes，20.27%)和散囊菌綱(Eurotiomycetes，18.27%)。 包含110 個屬，優(yōu)勢菌屬有鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、Apiotrichum和籃狀菌屬(Talaromyces)，豐度分別為13.35%、10.74%、8.32%、6.29%和5.09%。 此外，豐度＞1.00%的屬還有Oliveonia(2.80%)、Setophoma(2.60%)、皮狀絲孢酵母屬(Cutaneotrichosporon，2.58%)、Papiliotrema(2.48%)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，2.18%)、被孢霉屬(Mortierella，1.52%)、木霉屬(Trichoderma，1.37%)、Acidomelania(1.28%)和孢子絲菌屬(Sporothrix，1.25%)。 另有未分類真菌屬6.59%、叢赤殼科下未分類屬6.35%、子囊菌門下未分類屬4.52%、圓盤菌科下未分類屬2.61%、毛球殼科下未分類屬1.15%(圖4a)。

花生莖部內生真菌覆蓋7 個門，其中以擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)為主，豐度分別為43.39%和35.50%，另有未分類真菌門19.85%。 包含18 個綱，優(yōu)勢綱包括銀耳綱(Tremellomycetes，42.26%)和散囊菌綱(Eurotiomycetes，12.53%)。 包含72 個屬，優(yōu)勢真菌屬有Apiotrichum、絲孢酵母屬(Trichosporon)、皮狀絲孢酵母屬(Cutaneotrichosporon)和曲霉屬(Aspergil-lus)，豐度分別為17.99%、13.81%、7.60%和5.92%。此外，豐度＞1.00%的屬還有嗜熱子囊菌屬(Thermoascus，4.86%)、Papiliotrema(2.74%)、Cyberlindnera(1.63%)、Rasamsonia(1.49%)、暗球腔菌屬(Phaeosphaeria，1.23%)和假絲酵母屬(Candida，1.16%)。 另有未分類真菌屬19.85%、子囊菌門下未分類屬12.72%(圖4b)。

圖4 屬水平花生不同組織內生真菌群落組成分析

花生葉部內生真菌包含6 個門，以子囊菌門(Ascomycota)為主，豐度為97.08%。 包含13 個綱，優(yōu)勢綱為座囊菌綱(Dothideomycetes，94.52%)。包含49 個屬，優(yōu)勢菌屬為小光殼屬(Leptosphaerulina)和暗球腔菌屬(Phaeosphaeria)，豐度分別為65.64%和27.18%。 此外，豐度＞1.00%的還有Didymellaceae 下未分類屬1.58%、子囊菌門下未分類屬1.15%(圖4c)。

花生花部內生真菌包含5 個門，其中子囊菌門(Ascomycota)占絕對優(yōu)勢，豐度達到98.95%。包含12 個綱，主要以座囊菌綱(Dothideomycetes，97.98%)為主。 包含52 個屬，優(yōu)勢真菌屬為小光殼屬(Leptosphaerulina)，豐度達到95.45%。 此外，豐度＞1.00%的屬還有Didymellaceae 下未分類屬(2.40%，圖4d)。

2.3 花生不同組織內生真菌物種多樣性比較

花生根、莖、葉、花不同組織在門分類水平上比較相似，均以子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)為主，但在綱和屬分類水平上差異較大。 花生根部和莖部豐度＞1.00%的綱分別有9 個和5 個，且莖部包含的5 個綱均是兩者共有，說明根部和莖部含有的內生真菌在物種多樣性上比較接近。 葉部和花部均以座囊菌綱(Dothideomycetes)為主，豐度分別達到94.52%和97.98%，物種多樣性略顯單一。 在屬水平，花生根部和莖部豐度＞1.00%且能準確分類的屬分別有14 個和10 個，顯示了豐富的種群多樣性，而葉部和花部分別只有2 個和1 個。 基于屬水平的樣本層級聚類分析(圖5)顯示根部和莖部聚在一起，葉部和花部聚在一起，表明根部和莖部、葉部和花部含有的內生真菌物種具有較高的相似性。主成分分析(PCA)同樣表明根部和莖部內生真菌具有較高的相似度，兩者分布在第四象限且有明顯的聚集，葉部和花部分別分布在第二、第三象限(圖6)。

圖5 花生不同組織內生真菌層級聚類分析

圖6 花生不同組織內生真菌PCA 分析

2.4 花生不同組織內生真菌功能分析

基于FUNGuild 數據庫解析花生內生真菌的生態(tài)功能類別。 僅選擇可信等級為很可能(probable) 和極可能(highly probable)的OTU 和分類單元進行分析。 從表3 可知，花生內生真菌可分為8 個生態(tài)功能群，分別為地衣共生真菌(lichenized)、未定義腐生菌(undefined saprotroph)、動物病原菌(animal pathogen)、內生菌(endophyte)、木腐菌(wood saprotroph)、植物病原菌(plant pathogen)、糞生菌(dung saprotroph)、叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal)。 此外還有9 種混合營養(yǎng)生態(tài)功能群，分別為植物病原菌-未定義腐生菌(plant pathogen-undefined saprotroph)、動物病原菌-內生菌-植物腐生菌-土壤腐生菌(animal pathogenendophyte-plant saprotroph-soil saprotroph)、動物內共生菌-未定義腐生菌(animal endosymbiontundefined saprotroph)、糞生菌-植物腐生菌(dung saprotroph-plant saprotroph)、動物病原菌-未定義腐生菌(animal pathogen-undefined saprotroph)、糞生菌-植物腐生菌-木腐菌(dung saprotroph-plant saprotroph-wood saprotroph)、動物內共生菌-動物病原菌-內生菌-植物病原菌-未定義腐生菌(animal endosymbiont-animal pathogen -endophyte -plant pathogen-undefined saprotroph)、糞生菌-未定義腐生菌(dung saprotroph-undefined saprotroph)、內生菌-植物病原菌(endophyte-plant pathogen)。

表3 花生不同組織內生真菌生態(tài)功能群

以上17 種生態(tài)功能群中，花生根、莖、葉、花不同組織共有的功能群有2 個，分別為未定義腐生菌，分類屬為Rasamsonia；動物病原菌，分類屬為被毛孢屬(Hirsutella)。 不同組織樣本獨有功能群差異較大，其中根部獨有功能群最多，包括未定義腐生菌的Oliveonia、籃狀菌屬(Talaromyces)、內隔孢屬(Endophragmiella)、新赤殼屬(Neocosmos-pora)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、擬暗球腔菌屬(Phaeosphaeriopsis)、錐蓋傘屬(Conocybe)，動物病原菌的無柄霉屬(Acaulopage)，內生菌的Acidomelania、燒瓶狀霉屬(Lecythophora)，木腐菌的柱頂孢霉屬(Scytalidium)，植物病原菌的螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)，糞生菌的裂殼菌屬(Schizothecium)，動物病原菌-內生菌-植物腐生菌-土壤腐生菌中的孢子絲菌屬(Sporothrix)，糞生菌-植物腐生菌的光黑殼屬(Preussia)，叢枝菌根真菌的Rhizophagus，糞生菌-植物腐生菌-木腐菌的鬼傘屬(Coprinopsis)，糞生菌-未定義腐生菌的糞裸盤菌屬(Coprotus)，內生菌-植物病原菌的炭疽菌屬(Colletotrichum)。 葉部獨有的功能群最少，僅有未定義腐生菌的Leuconeurospora，植物病原菌的孢叢竿霉屬(Passalora)以及動物內共生菌-未定義腐生菌的畢赤酵母屬(Pichia)。

3 討論與結論

本試驗通過高通量測序技術研究了花生內生真菌的多樣性，突破了植物體內很多厭氧微生物不能體外分離培養(yǎng)的技術瓶頸[17，18]，全面覆蓋了整個植株體內的微生物多樣性信息。 結果表明，花生內生真菌隸屬于9 個門，25 個綱，51 個目，107 個科，155 個屬，表現出豐富的種群多樣性。Alpha 多樣性指數顯示，花生根部內生真菌在多樣性和豐富度上均是最高，莖部和葉部次之，花部最低。 從門的分類水平來看，花生內生真菌以子囊菌門和擔子菌門為主，這和陶剛[19]通過組織分離法研究白及內生真菌種群多樣性的結果一致。子囊菌門是花生體內的絕對優(yōu)勢菌門，在根、莖、葉和花不同部位的豐度分別為65.82%、35.50%、97.08%和98.95%。陳澤斌等[14]通過高通量測序技術研究了鐵皮石斛葉片內生真菌種群多樣性，發(fā)現鐵皮石斛葉片內生真菌主要隸屬于子囊菌門，豐度達到99.97%，與本研究花生葉片所含內生真菌分類結果相似。 除子囊菌門外，根部和莖部還有較高比例的擔子菌門，豐度分別為25.28%和43.39%；葉部和花部擔子菌門占比較低，豐度分別為2.08%和0.71%。 根部優(yōu)勢真菌屬為鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、Apiotrichum和籃狀菌屬(Talaromyces)，與熊丹等[20]研究發(fā)現不同區(qū)系杜鵑根部優(yōu)勢真菌屬為青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)和擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)的結論相差較大。 其原因可能是某些真菌在不同寄主的定殖情況不同或者是生境差異造成了內生真菌種群結構的多樣化。 此外，在花生根部和莖部還發(fā)現了一定比例的曲霉屬(Aspergillus)真菌，豐度分別為10.74%和5.92%。 曲霉屬真菌是一類重要的生防微生物，在植物促生和抗病方面有重要的利用價值。 如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)能產生促進植物生長的吲哚乙酸(IAA)[21]；分離自苦楝樹(Melia azedarach)的一株內生真菌Aspergillussp.能產生多種抑制植物病原菌如小麥赤霉(Gibberella saubinetti)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)生長的抗菌物質[22]。

利用FUNGuild 軟件將花生內生真菌進行生態(tài)功能群分類，一共獲得17 種功能群。 花生不同組織共有的生態(tài)功能群有兩個。 不同組織樣本獨有功能群數量有較大差異，其中根部獨有功能群最多，莖部和花部次之，葉部最少。 值得注意的是，FUNGuild 分析結果僅將絲孢酵母屬(Trichosporon)、被毛孢屬(Hirsutella)、綠僵菌屬(Metarhizium)、無柄霉屬(Acaulopage)4 個屬定義為動物病原菌。 已有研究表明部分動物病原菌能夠跨界侵染不同生物寄主[23]，如花生內生真菌未定義腐生菌群中的籃狀菌屬(Talaromyces)可導致人類感染暗色絲孢霉病[24]，所以該菌株應該同時被定義為動物病原菌群。 此外，炭疽菌屬(Colletotrichum)被定義為內生菌-植物病原菌混合功能群，說明內生真菌是一個在發(fā)育學上不穩(wěn)定的階段，其致病性可在整個生活史中相互轉化[25]。 如鐮刀菌一般被認為是植物病原菌，但內生鐮刀菌卻能增加玉米對黑斑病的抗性[26]。

本試驗通過高通量測序技術，研究了花生根、莖、葉、花不同部位中的內生真菌種群多樣性及其生態(tài)功能群結構，為研究內生真菌與花生互作關系，以及其在花生病害生物防治領域的應用奠定了基礎。