王彥青，許娜麗，余慧霞，姚明明，孫剛，陳佳靜，李清峰，劉彩霞，王掌軍

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

小麥(Triticum aestivumL.)作為世界上最重要的糧食作物之一，在世界各地廣泛種植，為全球約35%～40%人口提供主食[1]。 據(jù)預(yù)測(cè)，到2050年，世界人口將達(dá)97 億，對(duì)小麥的需求將會(huì)持續(xù)不斷地增加[2，3]。 高產(chǎn)是育種家一貫追求的目標(biāo)，小麥產(chǎn)量主要由單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重構(gòu)成，因此，在穩(wěn)定單位面積穗數(shù)和穗粒數(shù)的前提下增加粒重對(duì)小麥產(chǎn)量的提高具有重要作用。 千粒重在產(chǎn)量構(gòu)成三因素中受遺傳特性的影響最大，其主要受加性效應(yīng)基因的控制，早代選擇有效[4，5]。 優(yōu)質(zhì)也是當(dāng)前小麥育種的重要目標(biāo)之一，是促進(jìn)小麥供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、提升產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素[6]。 蛋白質(zhì)含量是小麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)最重要的一項(xiàng)指標(biāo)，面筋含量為影響小麥加工品質(zhì)的重要因素之一[7]。 利用高蛋白質(zhì)和面筋含量的基因資源對(duì)栽培小麥進(jìn)行遺傳改良，對(duì)選擇和培育優(yōu)質(zhì)小麥品種具有重要意義。 而小麥病害的發(fā)生嚴(yán)重制約其產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善[8]。 近年來(lái)，隨著水肥條件提升和群體密度加大，主要麥區(qū)小麥白粉病頻繁發(fā)生，致其減產(chǎn)和品質(zhì)下降。小麥白粉病由專性寄生真菌白粉菌(Blumeria graminisf. sp.tritici)引起，病情發(fā)生可貫穿整個(gè)生育期，主要危害植株地上部，影響功能葉片的光合作用[9，10]。 化學(xué)及其它防治措施雖已取得階段性成效，但實(shí)踐證明，選育和推廣抗病品種是防治白粉病危害最經(jīng)濟(jì)有效和安全的措施。

小麥多數(shù)性狀屬于多基因控制的數(shù)量性狀[11]。 分子標(biāo)記和QTL 定位技術(shù)的發(fā)展為小麥的分子檢測(cè)和數(shù)量性狀的研究提供了有效方法[12]。 已有文獻(xiàn)報(bào)道了小麥粒重、蛋白質(zhì)與濕面筋含量及白粉病抗性等性狀的QTL[13-18]。 Cui等[4]發(fā)現(xiàn)在5B、6A 和7B 染色體上分別存在控制小麥粒重的穩(wěn)定主效QTL 位點(diǎn)QTkw-5B.1、QTkw-6A.2和QTkw-7B.1，分別能解釋表型變異的11.28%～16.06%、5.64%～18.69%和6.76%～21.16%。郭利建等[12]以構(gòu)建的F2群體為材料，檢測(cè)到11 個(gè)粗蛋白含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、4B 染色體上，表型貢獻(xiàn)率為0.69%～2.48%；12 個(gè)為濕面筋含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、3B、4B 染色體上，表型貢獻(xiàn)率為0.58%～2.37%。 王掌軍等[19]在小麥F2∶5家系中檢測(cè)到14 個(gè)粗蛋白含量QTL，LOD 值最大為14.90，表型貢獻(xiàn)率為4.00%～6.00%，加性效應(yīng)為-0.51 ～0.29；16 個(gè)濕面筋含量QTL，LOD值最大為14.00，表型貢獻(xiàn)率為3.00%～5.00%，加性效應(yīng)為-1.22～0.54。 李欣等[20]以小麥RILs 群體為材料，在2A、2B、2D 和3B 染色體上共定位到5 個(gè)白粉病抗性QTL，分別是QPm.sac-2A、QPm.sac-2B.1、QPm.sac-2B.2、QPm.sac-2D和QPm.sac-3B，其中QPm.sac-2B.1的表型變異解釋率最高，達(dá)到30.60%～33.60%。 以上雖然報(bào)道了很多小麥相關(guān)性狀的QTL，但真正有育種利用價(jià)值的QTL亟待研究和應(yīng)用。 本研究針對(duì)寧夏小麥產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的需求與育種資源相對(duì)匱乏的瓶頸，以主要性狀優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的寧夏主栽品種寧春4 號(hào)(綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良、適應(yīng)性好、但品質(zhì)一般、感白粉病)和云南小麥品種云麥52 號(hào)(千粒重高、粗蛋白和濕面筋含量均較高、免疫白粉病)分別為母本、父本雜交并構(gòu)建F2代群體，繼而對(duì)其粒重、粗蛋白含量、濕面筋含量、白粉病抗性等性狀進(jìn)行分子標(biāo)記及QTL 分析，發(fā)掘綜合性狀優(yōu)異的育種中間材料和QTL，以期為寧夏小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)及抗病性遺傳改良提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年，以寧夏主栽小麥品種寧春4 號(hào)為母本、云南省小麥品種云麥52 號(hào)為父本配制雜交組合，同年收獲雜交種子；2020年將雜交種子點(diǎn)播于寧夏大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，收獲F1代；2021年種植F1代，得到共包含476 個(gè)單株的F2代群體。 每年同時(shí)種植父、母本，5 行區(qū)，行長(zhǎng)1.10 m，行寬0.20 m。田間同大田管理。 以上材料均由寧夏大學(xué)小麥育種課題組提供。

1.2 性狀測(cè)定及方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀考察 參照《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[21]進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察。 成熟期選收長(zhǎng)勢(shì)一致的親本材料各15 株和所有F2代單株進(jìn)行室內(nèi)考種。 其中，株高、穗下莖長(zhǎng)和穗長(zhǎng)測(cè)定采用直接測(cè)量法，在考種表上直接記錄；小穗數(shù)和結(jié)實(shí)小穗數(shù)測(cè)定采用直接觀測(cè)法，有效小穗數(shù)＝結(jié)實(shí)小穗數(shù)＋不孕小穗數(shù)；穗粒數(shù)和穗粒重為單穗的平均粒數(shù)和粒重，親本千粒重為1000 粒種子的重量，F(xiàn)2代群體粒重為100 粒種子的重量。經(jīng)濟(jì)系數(shù)＝經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量/生物學(xué)產(chǎn)量，其中，生物學(xué)產(chǎn)量為收獲后未脫粒前的植株重量，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量為脫粒后的籽粒重量。

1.2.2 品質(zhì)性狀測(cè)定 國(guó)家小麥改良中心西北分中心(寧夏銀川)用瑞典Perton 公司DA7200 型近紅外分析儀[22]測(cè)定小麥品質(zhì)性狀，重復(fù)5 次。小麥近紅外校準(zhǔn)曲線由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心建模，由國(guó)家小麥改良中心西北分中心(寧夏銀川)校正，結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析。

1.2.3 抗白粉病調(diào)查 成株期白粉病田間抗性鑒定參照盛寶欽等[23]改進(jìn)的0 ～9 級(jí)法，其中，0級(jí)為免疫(immune，I)，0；級(jí)為近免疫(nearly immune，NI)，1 ～2 級(jí)為高抗(highly resistant，HR)，3～4級(jí)為中抗(moderately resistant，MR)，5 ～6 級(jí)為中感(moderrately susceptible，MS)，7 ～8 級(jí)為高感(highly susceptible，HS)，9 級(jí)為極感(extremely susceptible，ES)。

1.2.4 分子標(biāo)記分析 采用SDS 法提取小麥葉片基因組DNA[24]。 利用本實(shí)驗(yàn)室定位于普通小麥7 個(gè)部分同源群上的957 對(duì)SSR 引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 本研究能夠檢測(cè)到QTL 位點(diǎn)的9 個(gè)SSR 引物信息(表1)。PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參見(jiàn)王掌軍等[25]的方法，其中退火溫度均為56℃，擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電壓為180 V，電泳約1.5 h，銀染后觀察、照相，并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 SSR 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2013 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，利用IBM SPSS Statistics 25 軟件對(duì)親本與F2代群體的粒重、粗蛋白含量、濕面筋含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并對(duì)其在F2代群體的頻率分布進(jìn)行作圖；運(yùn)用QTL IciMapping 4.0 軟件中SMA 模型對(duì)粒重、粗蛋白含量、濕面筋含量和白粉病抗性進(jìn)行QTL分析[26]。 QTL 命名方法為:q＋目標(biāo)性狀英文大寫(xiě)字母縮寫(xiě)＋所在染色體，如3A 染色體上與粒重相關(guān)的QTL 位點(diǎn)命名為qGW3A。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧春4 號(hào)與云麥52 號(hào)農(nóng)藝、品質(zhì)性狀及白粉病抗性分析

對(duì)2 個(gè)親本的10 個(gè)農(nóng)藝性狀、7 個(gè)品質(zhì)性狀及成株期田間白粉病抗性進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)表明，寧春4 號(hào)穗長(zhǎng)及籽粒水分含量、硬度指數(shù)、容重和出粉率均顯著高于云麥52 號(hào)，而云麥52號(hào)株高較矮，其千粒重、粗蛋白含量和濕面筋含量均優(yōu)于寧春4 號(hào)，其它性狀2 個(gè)親本間無(wú)顯著差異。 寧春4 號(hào)高感白粉病，病級(jí)7 ～8 級(jí)，云麥52號(hào)為免疫白粉病。

表2 寧春4 號(hào)和云麥52 號(hào)農(nóng)藝與品質(zhì)性狀

2.2 F2代群體粒重、粗蛋白與濕面筋含量及白粉病抗性分析

2.2.1 F2代群體粒重、粗蛋白與濕面筋含量變異分析 對(duì)包含476 個(gè)單株的F2代群體粒重、粗蛋白與濕面筋含量的分布頻率進(jìn)行分析，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)性狀在F2代群體中均出現(xiàn)較大分離，呈連續(xù)正態(tài)分布。 表明這些性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，且在F2代群體中出現(xiàn)許多具有超親性狀的單株。

圖1 F2代群體粒重、粗蛋白和濕面筋含量頻率分布

同時(shí)，對(duì)F2代群體粒重、粗蛋白與濕面筋含量進(jìn)行變異分析，結(jié)果(表3)表明，F(xiàn)2代群體粒重平均值介于雙親之間，粗蛋白與濕面筋含量平均值均低于低親。 其中，群體粒重、粗蛋白含量、濕面筋含量超中親比例分別達(dá)37.61%、14.71%和12.18%，超高親比例分別達(dá)15.97%、9.66%和8.61%。由此看出，群體粒重、粗蛋白與濕面筋含量均表現(xiàn)出較大變異，變異系數(shù)分別為19.78%、13.22%和14.98%。

表3 F2代群體粒重、粗蛋白含量和濕面筋含量變異分析

2.2.2 F2代群體白粉病抗性分析 對(duì)F2代群體所包含單株進(jìn)行成株期田間白粉病抗性調(diào)查，結(jié)果(表4)表明，476 個(gè)F2代單株中有235 個(gè)(占49.37%)表現(xiàn)為抗白粉病，其中，免疫、高抗、中抗白粉病單株分別為199 個(gè)、29 個(gè)和7 個(gè)，其它241個(gè)單株表現(xiàn)不同程度感白粉病。

表4 F2代群體白粉病抗性表現(xiàn)

2.3 親本及F2代群體分子標(biāo)記分析

2.3.1 多態(tài)性分子標(biāo)記篩選 在2 個(gè)親本上篩選多態(tài)性SSR 引物，結(jié)果(表5)表明，957 對(duì)引物中有144 對(duì)具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為15.05%，其中分布于小麥A、B、D 染色體組引物的多態(tài)性比率分別為19.94%、13.11%和11.87%。 部分引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 2 個(gè)親本部分多態(tài)性SSR 引物的擴(kuò)增結(jié)果

表5 篩選的多態(tài)性SSR 引物分布及數(shù)量

2.3.2 F2代群體粒重、粗蛋白與濕面筋含量及白粉病抗性QTL 分析 144 對(duì)多態(tài)性SSR 引物在F2代群體中穩(wěn)定擴(kuò)增的有32 對(duì)。 用這32 對(duì)引物對(duì)群體進(jìn)行QTL 檢測(cè)，其中9 個(gè)標(biāo)記對(duì)粒重、粗蛋白與濕面筋含量及白粉病抗性有明確定位結(jié)果，共檢測(cè)到22 個(gè)QTL(表6)。 這些QTL 涉及2A、3A、7A、2B、4D和5D共6條染色體，LOD值最大為13.00，表型貢獻(xiàn)率為2.87%～11.82%，加性效應(yīng)為-0.76 ～1.42。 其中，檢測(cè)到1 個(gè)粒重QTL，位于3A 染色體，LOD 值為3.98，表型貢獻(xiàn)率為3.78%；9 個(gè)粗蛋白含量QTL，分布于2A、3A、7A、2B、4D 和5D 染色體上，LOD 值最大為13.00，表型貢獻(xiàn)率為3.00%～11.82%；9 個(gè)濕面筋含量QTL，分布于2A、3A、7A、2B、4D 和5D 染色體上，LOD 值最大為10.77，表型貢獻(xiàn)率為2.99%～9.89%；3 個(gè)白粉病抗性QTL，分布于3A、2B 和5D染色體上，LOD 值最大為3.79，表型貢獻(xiàn)率為2.87%～3.60%。 同時(shí)，標(biāo)記Xbarc105 檢測(cè)到群體粒重、 粗蛋白含量和濕面筋含量 QTL；XbarcM171、Xgwm249 和Xpsp3094 均檢測(cè)到粗蛋白含量和濕面筋含量QTL；Xbarc57、Xwmc160 和Xwmc317 均檢測(cè)到粗蛋白含量、濕面筋含量和白粉病抗性QTL。 以上這些標(biāo)記所在位點(diǎn)存在不同性狀QTL 富集區(qū)。

表6 F2代群體粒重、粗蛋白含量、濕面筋含量和白粉病抗性QTL 分析

3 討論與結(jié)論

小麥對(duì)人類生活和生產(chǎn)有著極其重要的作用，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)及抗病小麥新品種是當(dāng)前育種的主要任務(wù)。 小麥的最終產(chǎn)量是由多個(gè)性狀共同作用的結(jié)果[27]，而粒重是影響產(chǎn)量形成的重要因素之一，且受遺傳特性影響最大[4]。 有研究表明，山東省1999—2010年小麥產(chǎn)量平均每年提高61.65 kg/hm2，但產(chǎn)量構(gòu)成要素中只有粒重呈顯著上升趨勢(shì)[28]。 本研究發(fā)現(xiàn)，云麥52 號(hào)千粒重較高，可以作為育種親本改良寧夏栽培小麥品種的粒重進(jìn)而提高產(chǎn)量，且在F2代發(fā)現(xiàn)分別有37.61%和15.97%的單株屬于超中親和超高親類型。 蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量分別為小麥營(yíng)養(yǎng)和加工品質(zhì)的重要指標(biāo)。 蛋白質(zhì)性狀的遺傳力較高，變異受環(huán)境影響較小，應(yīng)從早期世代開(kāi)始進(jìn)行選擇[29-32]。 F2代各遺傳性狀處于高度分離狀態(tài)，能夠提供最大的數(shù)量遺傳信息，是選擇的關(guān)鍵世代。 本研究表明，F(xiàn)2代群體的粗蛋白和濕面筋含量平均值分別為13.76%、28.58%，超中親比例分別為14.71%、12.18%，超高親比例分別為9.66%、8.61%，而且2 個(gè)性狀的變異系數(shù)均較大，具有選擇潛力。 這與姜朋[33]、柴永峰[34]等的研究結(jié)果相符，而杭雅文等[35]認(rèn)為，籽粒蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量的變異系數(shù)較小，這可能與材料數(shù)量、栽培條件和測(cè)試手段等有關(guān)。

近幾年，白粉病已成為寧夏小麥生產(chǎn)的第一大病害，這就要求在發(fā)病充分的條件下，利用大群體進(jìn)行多年多點(diǎn)抗白粉病鑒定，同時(shí)要進(jìn)行單個(gè)毒性小種鑒定，這樣才能對(duì)育種材料的抗性和生理小種的毒性做出科學(xué)、可靠的評(píng)價(jià)，進(jìn)而選育和推廣抗病小麥品種以解決白粉病的危害。 云麥52 號(hào)攜帶來(lái)自于簇毛麥6VS 的Pm21基因，對(duì)白粉病免疫，以期在寧夏小麥抗白粉病遺傳改良中發(fā)揮作用。 本研究在F2代中發(fā)現(xiàn)235 個(gè)單株表現(xiàn)為抗白粉病。 該結(jié)果具有一定參考性，這些抗白粉病單株也具有一定利用價(jià)值。

分子標(biāo)記為小麥數(shù)量性狀研究提供了可靠的技術(shù)手段[12]。 本研究在3A 染色體上檢測(cè)到一個(gè)粒重相關(guān)QTL，表型貢獻(xiàn)率為3.78%，而王瑞霞等[36]在3A 染色體上定位到籽粒長(zhǎng)、寬相關(guān)的QTL，說(shuō)明在3A 染色體上存在著籽粒相關(guān)的QTL；9 個(gè)粗蛋白含量QTL 和9 個(gè)濕面筋含量QTL，表型貢獻(xiàn)率分別為3.00%～11.82%、2.99%～9.89%，分布在2A、3A、7A、2B、4D、5D 染色體上，這與王掌軍等[19]以寧春4 號(hào)與河?xùn)|烏麥雜交后代的F2:5家系為材料的定位結(jié)果基本一致，說(shuō)明這些染色體上的確存在控制籽粒蛋白質(zhì)性狀的QTL；3 個(gè)不同于Pm21基因的抗白粉病QTL，分布在3A、2B、5D 染色體上，表型貢獻(xiàn)率為2.87%～3.60%，李欣等[20]在2B 染色體上定位到1 個(gè)主效QTLQPm. sac - 2B. 1，可 解 釋 表 型 變 異 率 達(dá)30.6%～33.6%，與本研究所定位置相近，同時(shí)，本研究在3A 和5D 染色體上各定位到1 個(gè)抗白粉病QTL，可能為調(diào)控小麥白粉病抗性新位點(diǎn)。 今后，需通過(guò)開(kāi)發(fā)高效的分子標(biāo)記構(gòu)建密度飽和的物理圖譜，進(jìn)而使粒重、粗蛋白與濕面筋含量及抗白粉病QTL(尤其是主效QTL)得以精細(xì)定位，為寧夏小麥遺傳改良提供分子基礎(chǔ)和基因資源。