郭燦，程敦公，齊軍山，劉曉晗，劉海琛，劉秀坤，陳志偉，單寶雪，肖彥軍，張玉梅，趙振東，李法計(jì)，李豪圣

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100；4. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；5. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太古 030801)

小麥莖基腐病(Fusarium crown rot，F(xiàn)CR)是由多種鐮刀菌侵染引起的世界性小麥病害，以假禾谷鐮刀菌(Fusarium pseudograminearum)侵染為主[1，2]。 小麥幼苗被鐮刀菌侵染后，莖基部葉鞘和莖稈變褐，嚴(yán)重時(shí)引起幼苗發(fā)黃、枯萎；灌漿期發(fā)病可導(dǎo)致穗子干枯，以致籽粒秕瘦[3，4]。 近年來在我國(guó)小麥主產(chǎn)省份，河南省每年約有10%的小麥?zhǔn)蹻CR 影響，部分地區(qū)產(chǎn)量損失達(dá)50%[5，6]；河北省小麥由FCR 引起的白穗率為20% ～50%[7]；山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全省小麥FCR 發(fā)病面積達(dá)80 萬公頃以上，部分地塊白穗率達(dá)30%～50%。 因此，F(xiàn)CR 已成為影響我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害之一。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從抗病基因發(fā)掘和種質(zhì)資源鑒定等方面開展了一系列研究。 在抗病基因發(fā)掘方面，于1A、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4B、5B、5D、6A、6B 和6D 等染色體上定位到超過60 個(gè)FCR 相關(guān)QTL 或顯著性位點(diǎn)[3，8-22]。 Ma 等[12]在3BL 染色體上檢測(cè)到一個(gè)FCR 主效QTL，可以解釋49%的表型變異；Zheng 等[23]通過構(gòu)建次生分離群體，將前期定位到的主效QTLQcrs.cpi-3B精細(xì)定位到0.7 cM(1.5 Mb)區(qū)間內(nèi)。 在抗病資源鑒定方面，通過苗期和成株期接種鑒定，檢測(cè)到西農(nóng)979、豫麥18、石優(yōu)17 等約30 個(gè)具有較強(qiáng)FCR抗性的品種[21，24，25]。 但是，已發(fā)掘的主效抗病基因少且分子標(biāo)記缺乏、可用于育種的抗源匱乏仍是當(dāng)前抗病育種工作面臨的主要問題。

為繼續(xù)發(fā)掘FCR 抗病位點(diǎn)，本研究以藁城8901/周麥16 構(gòu)建的重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體為材料，結(jié)合構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，對(duì)苗期莖基腐病抗性QTL 進(jìn)行定位，以期為發(fā)掘抗病基因和聚合育種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以藁城8901/周麥16 構(gòu)建的重組自交系群體(176，F(xiàn)2∶6RILs)為研究材料。 其中，藁城8901 是河北省藁城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種，周麥16 是河南省周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的矮稈小麥品種。 前期觀察發(fā)現(xiàn)，藁城8901 的FCR 抗性優(yōu)于周麥16。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌擴(kuò)繁、接種和幼苗培養(yǎng) 將假禾谷鐮刀菌接種到PDA 培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)滿整個(gè)平板，接入滅菌的麥粒培養(yǎng)基中于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周左右，定時(shí)搖晃，確保病原菌均勻分布在麥粒表面。 長(zhǎng)滿后備用。

培養(yǎng)前，將麥粒培養(yǎng)基擴(kuò)繁的病原菌和無菌土以3∶100 的質(zhì)量比例混勻，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)盆(7 cm×7 cm×7 cm)中，每盆播種8 粒種子，每個(gè)家系播種3 盆，放置溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 根據(jù)培養(yǎng)盆內(nèi)土壤濕度定期澆水，試驗(yàn)期間不施用任何肥料。 白天溫度控制在25℃左右，夜間溫度控制在20℃左右，連續(xù)培養(yǎng)30 天后調(diào)查。 分別于2020年12月和2021年5月、8月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所溫室內(nèi)進(jìn)行3 次試驗(yàn)(T1、T1 和T3)。

1.2.2 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及病情指數(shù)計(jì)算 每個(gè)家系調(diào)查15 株幼苗，參照楊云等[26]的試驗(yàn)方法對(duì)發(fā)病度進(jìn)行分級(jí)，并計(jì)算病情指數(shù)。 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0 級(jí):植株未發(fā)??；1 級(jí):地下莖明顯變褐或第1 葉鞘出現(xiàn)輕微癥狀；3 級(jí):第1 葉鞘明顯變褐，但未變黑；5 級(jí):第1 葉鞘變黑或第2 葉鞘變褐；7 級(jí):第3 葉鞘出現(xiàn)變褐癥狀，或植株因發(fā)病而發(fā)育遲緩或接近死亡；9 級(jí):植株因病死亡。 病情指數(shù)計(jì)算公式為:

根據(jù)病情指數(shù)，將苗期抗病性分為5 類:免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、感病(S)和高感(HS)，相應(yīng)病情指數(shù)分別為0、0.01 ～10.00、10.01 ～20.00、20.01～30.00 和＞30.00。

1.2.3 基因型檢測(cè)和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建 于苗期進(jìn)行取樣，提取藁城8901/周麥16 RIL 群體和親本基因組DNA，在北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司(http:/ /cn.capitalbio.com/)進(jìn)行小麥90K SNP 基因芯片檢測(cè)，檢測(cè)完畢后對(duì)標(biāo)記質(zhì)量進(jìn)行篩選。

RIL 群體遺傳連鎖圖譜構(gòu)建參照文獻(xiàn)[27]。具體步驟如下:第一，利用IciMapping v4.2 軟件的BIN 功能將相互之間沒有交換的標(biāo)記分到同一組內(nèi)，并挑選缺失率最低的標(biāo)記作為該組的骨架標(biāo)記；第二，采用JoinMap 4.0 軟件的Grouping 功能對(duì)骨架標(biāo)記進(jìn)行分群；第三，利用MapDisto 1.7 軟件的AutoMap 功能對(duì)骨架標(biāo)記進(jìn)行排序，并計(jì)算遺傳距離；最后，結(jié)合中國(guó)春小麥基因組數(shù)據(jù)(IWGSC RefSeq v1.0，https:/ /urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/blast.php)確定每個(gè)連鎖群所在的染色體。

1.2.4 QTL 分析 利用骨架標(biāo)記和苗期FCR 病情指數(shù)，采用IciMapping v4.2 的完備區(qū)間作圖法(ICIM)進(jìn)行QTL 分析。 在P＝0.01 水平下，所有位點(diǎn)2000 次排列檢驗(yàn)預(yù)測(cè)LOD 閾值介于2.0 ～2.5 之間，因此，為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，本研究選擇2.5 作為L(zhǎng)OD 閾值用于鑒定顯著QTL。 不同試驗(yàn)中置信區(qū)間有重疊的視作同一QTL，參考中國(guó)春小麥基因組物理圖譜對(duì)本研究定位到的QTL 與已報(bào)道QTL 進(jìn)行比較(IWGSC RefSeq v1.0，https:/ /urgi. versailles. inra. fr/blast _ iwgsc/blast.php)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SAS進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情指數(shù)方差分析及表型分析

方差分析結(jié)果(表1)顯示，藁城8901/周麥16 RIL 群體苗期FCR 病情指數(shù)在基因型和試驗(yàn)間均在0.01 水平差異顯著。 因此，可用于抗病性遺傳分析。

表1 小麥苗期莖基腐病病情指數(shù)方差分析

表型分析結(jié)果(表2)表明，在3 次試驗(yàn)中，周麥16 苗期FCR 病情指數(shù)均高于藁城8901，周麥16 表現(xiàn)為高感，藁城8901 表現(xiàn)為感病。 RIL 群體苗期FCR 病情指數(shù)均表現(xiàn)為超親分離，抗性范圍為中抗到高感。

表2 小麥苗期莖基腐病病情指數(shù)表型分析

2.2 遺傳連鎖圖譜

在RIL 群體中，共有11979 個(gè)高質(zhì)量多態(tài)性SNP 標(biāo)記。 選取3242 個(gè)骨架標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記被分到34 個(gè)連鎖群中，連鎖圖譜總長(zhǎng)度為3130.3 cM(表3)。 其中，B 染色體組骨架標(biāo)記數(shù)目最多，遺傳連鎖圖長(zhǎng)度最長(zhǎng)，標(biāo)記在染色體上的平均密度也最大；D 染色體組骨架標(biāo)記數(shù)目最少，遺傳連鎖圖長(zhǎng)度最短，標(biāo)記的密度也最小。標(biāo)記在染色體上的平均密度為1.04 個(gè)標(biāo)記/cM。

表3 藁城8901/周麥16 RIL 群體遺傳連鎖圖譜信息

2.3 QTL 定位

對(duì)3 次試驗(yàn)及平均值進(jìn)行QTL 分析，分別檢測(cè)到3、4、3、4 個(gè)QTL，分布在1D(2)、3B(2)、4A(2)、5B(2)、5D、6A(4)和7B 染色體上，解釋表型變異的4.42%～11.37%(表4，圖1)。

圖1 藁城8901/周麥16 RIL 群體苗期莖基腐病抗性QTL 位置圖

表4 苗期莖基腐病抗性QTL

4 個(gè)QTL 在兩次試驗(yàn)中均被檢測(cè)到。QFCR-S.saas-1DL同時(shí)在T3 和均值中檢測(cè)到，分別解釋表型變異的7.06%和5.62%；QFCR-S.saas-4AS同時(shí)在T1 和均值中檢測(cè)到，分別解釋表型變異的6.71%和6.84%；QFCR-S.saas-6AS-1同時(shí)在T2和T3 中檢測(cè)到，分別解釋表型變異的4.60%和9.42%；QFCR-S.saas-6AS-2同時(shí)在T2 和均值中檢測(cè)到，分別解釋表型變異的5.60%和7.73%。位于7BL 染色體上的QFCR-S.saas-7BL解釋的表型變異最高，達(dá)11.37%。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著秸稈還田的實(shí)施，土壤中病原菌積累量逐年增加，由此引起的小麥FCR 已逐漸成為黃淮麥區(qū)和北部冬麥區(qū)主要病害之一，影響遍及河北、山東、山西、河南、安徽、江蘇等省份，造成的糧食損失逐年增加[5-7]。 化學(xué)防治不僅耗費(fèi)巨大，而且對(duì)環(huán)境安全造成嚴(yán)重影響，不利于農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展，而培育抗病品種是應(yīng)對(duì)FCR 危害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。 抗病品種的培育不僅需要抗性穩(wěn)定的抗源用于配制雜交組合，還需要明確的抗病機(jī)理指導(dǎo)材料選擇。 由于我國(guó)小麥FCR 研究起步較晚，尚未發(fā)掘到主效抗病基因并廣泛應(yīng)用，抗病品種和種質(zhì)發(fā)掘數(shù)目也極少，難以滿足育種應(yīng)用。 因此，繼續(xù)發(fā)掘抗病基因和優(yōu)異種質(zhì)，不僅有利于抗病遺傳機(jī)制解析，還可為聚合育種提供可用材料。

小麥FCR 抗性由多基因控制，前人研究將抗病基因定位在小麥絕大多數(shù)染色體上，其中3B和4B 染色體QTL 數(shù)目最多，分別有9 個(gè)和10個(gè)[8-22]。 本研究檢測(cè)到的14 個(gè)苗期FCR 抗病QTL 中，有4 個(gè)在兩次試驗(yàn)中穩(wěn)定存在。 其中，3B 染色體上的QFCR-S.saas-3B-1與Pariyar等[19]通過關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到的顯著性標(biāo)記CAP12_rep_c3868_270 物理位置相距約1 Mb，可能為同一位點(diǎn)。 1DL 染色體上檢測(cè)到的QFCR-S.saas-1DL，與Collard[9]、Bovill[11]、Martin[17]、周淼平[18]等在該染色體上檢測(cè)到的QTL 位置不一致；此外，6A 染色體上兩個(gè)穩(wěn)定存在的QTL 位置也與Yang[21]、Rahman[22]等報(bào)道的位點(diǎn)不一致，還需做進(jìn)一步研究。

江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所以高感赤霉病的小麥品種阿夫與中感赤霉病品種臺(tái)灣小麥雜交，于20 世紀(jì)70年代初育成赤霉病抗性超親的高抗品種蘇麥3 號(hào)[28]。 本研究中，用感和高感FCR 創(chuàng)建的RIL 群體中，部分家系FCR 抗性水平達(dá)到中抗，說明基因重組、累加、互作，嚴(yán)格選擇和鑒定雜種后代，有可能育成超親抗病新品種。 程順和等[29]認(rèn)為避開豐產(chǎn)性差的抗源的應(yīng)用，重視豐產(chǎn)性好、不高感赤霉病的親本間配組，把抗赤霉病育種作為大面積豐產(chǎn)育種的一部分，并提出用中感到中抗的豐產(chǎn)親本材料進(jìn)行配組取代赤霉病抗性好但豐產(chǎn)性很差的親本，在后代鑒定篩選時(shí)，針對(duì)豐產(chǎn)性的同時(shí)進(jìn)行赤霉病抗性選擇，以解決豐產(chǎn)與赤霉病抗性之間的矛盾。 在今后小麥抗FCR 育種中也應(yīng)兼顧抗性和豐產(chǎn)性。