郭勝存，張勝葉，戶富棟，陳 熙，陳 魁

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

斑塊內(nèi)新生的滋養(yǎng)血管通常為不成熟血管，其血管內(nèi)皮不連續(xù)、基底膜不完整且缺乏周細(xì)胞，易發(fā)生滲漏[1-2]，故與斑塊不穩(wěn)定性顯著相關(guān)，且可能成為治療穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)易損斑塊的靶點(diǎn)；而易損斑塊中約80%微血管結(jié)構(gòu)不成熟[1]?，F(xiàn)有抑制血管新生藥物缺乏靶向性，且全身毒副作用嚴(yán)重[3-4]。超聲介導(dǎo)微泡破壞所致空化效應(yīng)可對不成熟血管壁直接產(chǎn)生局部物理損傷效應(yīng)，無全身毒副作用，而對正常組織內(nèi)成熟血管無顯著影響[2,5]。本研究觀察超聲聯(lián)合微泡選擇性破壞小鼠腹主動脈不穩(wěn)定斑塊內(nèi)不成熟血管的可行性及其對斑塊不穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 于北京大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心購入30只8周齡雄性載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-)，體質(zhì)量18～20 g，以高脂飲食(0.15%膽固醇、21%脂肪)飼養(yǎng)至30周齡，建立動脈不穩(wěn)定斑塊模型。將小鼠模型隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=12)、未干預(yù)組(n=12)及對照組(n=6)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審查并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2021-KY-0994-002)。

1.2 制備微泡及評價其特性 參考文獻(xiàn)[2,6]方法制備包裹全氟丙烷脂質(zhì)微泡，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ谥苽浜蠹纯碳?周后以顯微鏡觀察微泡形態(tài)，并取20 μl微泡，以庫爾特粒子計(jì)數(shù)儀檢測其粒徑及濃度。

1.3 超聲造影 采用Siemens Sequoia 512超聲診斷儀，15L7探頭，頻率7 MHz。將探頭固定于腹主動脈長軸，采集常規(guī)超聲圖像。對實(shí)驗(yàn)組及未干預(yù)組經(jīng)鼠尾靜脈彈丸式注入0.1 ml微泡，以機(jī)械指數(shù)為0.18的造影對比脈沖序列模式行超聲造影，保存圖像至顯影圖像廓清，評估微泡在體內(nèi)的顯影時間[7]；并于造影后處死未干預(yù)組小鼠。

1.4 超聲治療 以脈沖式超聲空化治療儀(DCT-700，深圳市威爾德醫(yī)療電子有限公司)對實(shí)驗(yàn)組及對照組行超聲治療。實(shí)驗(yàn)組于經(jīng)尾靜脈彈丸式注入0.1 ml微泡 8～10 s后以超聲輻照腹主動脈斑塊對應(yīng)體表區(qū)域[2]，能量3.0 MPa，探頭頻率1.0 MHz，超聲發(fā)射占空比0.19%，間歇輻照模式(探頭發(fā)射工作2 s后間歇8 s)，脈沖重復(fù)頻率10 Hz，治療時間1 min；治療后24 h隨機(jī)處死6只，余6只飼以高脂飲食至后8周處死。對照組小鼠及接受相同方式超聲治療及高脂飲食飼養(yǎng)，8周后被處死。

1.5 病理檢查 分離并取出腹主動脈組織，行HE、Masson染色，觀察脂質(zhì)沉積和膠原纖維，以Image J軟件面積法分別測量其含量[7]；分別以CD68和α-SMA標(biāo)記巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，以免疫組織化學(xué)法評價其在斑塊中的含量，以斑塊內(nèi)見棕黃色或黃褐色區(qū)域?yàn)槠浔磉_(dá)陽性，并采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行半定量分析，以測量目標(biāo)的面積與斑塊總面積的比值代表其相對含量，并根據(jù)公式1、2計(jì)算斑塊易損指數(shù)及核/帽比值[7]：

(1)

(2)

以CD31標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，以免疫組織化學(xué)法檢測斑塊內(nèi)微血管，斑塊內(nèi)見棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇代表1條單獨(dú)的微血管；以CD31和α-SMA共同標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，以熒光染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，采用免疫熒光染色法檢測斑塊內(nèi)不成熟血管，將1個CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞周圍缺乏α-SMA陽性周細(xì)胞定義為1條不成熟血管或新生血管。于100倍光鏡下觀察標(biāo)本，選擇3個血管著色最豐富區(qū)域；轉(zhuǎn)換400倍光鏡觀察視野中的微血管數(shù)，取3個視野的平均值，評估斑塊微血管密度(micro-vessel density, MVD)[8]；以Image-Pro Plus軟件對所取視野免疫熒光圖片進(jìn)行合并通道(Merge)，評價斑塊內(nèi)不成熟血管MVD，并計(jì)算成熟血管的MVD。對心、肝、腎及肺組織行HE染色，評估微泡安全性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。對計(jì)量資料以Shapiro-Wilk檢驗(yàn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以±s表示符合正態(tài)分布者，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以Pearson相關(guān)分析評估兩變量之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微泡特性 新鮮制備微泡的濃度為8.62×108個/ml，粒徑0.88～3.44 μm，平均(2.16±1.28)μm；約99.1%的微泡直徑<7 μm(圖1A)，光學(xué)顯微鏡下微泡形態(tài)完整、規(guī)則、細(xì)密、分布較均勻(圖1B)。置于4℃冰箱貯存1周后，微泡濃度、粒徑及形態(tài)均無明顯改變(圖1C、1D)。

二維超聲見小鼠腹主動脈內(nèi)膜不同程度局限性增厚(圖2A)，CDFI示局部血流豐富(圖2B)，即斑塊形成；超聲造影見斑塊局部增強(qiáng)(圖2C)。注入微泡后約9 s，未干預(yù)組腹主動脈顯影達(dá)峰(圖3A)，峰值減半時間為5.78～10.63 min，中位峰值減半時間為8.08 min(圖3B)，廓清時間為15.34～20.49 min，中位廓清時間為17.92 min(圖3C)。

2.2 斑塊MVD與斑塊易損性 CD31染色顯示未干預(yù)組腹主動脈斑塊內(nèi)含豐富微血管(圖4A、4B)；HE和Masson染色顯示斑塊內(nèi)存在大量脂質(zhì)沉積(圖4C)和少量膠原纖維(圖4D)；CD68和α-SMA染色顯示斑塊內(nèi)表達(dá)大量巨噬細(xì)胞(圖4E)和少量平滑肌細(xì)胞(圖4F)。腹主動脈斑塊MVD為43～144條/視野，平均(88.25±30.5)條/視野，易損指數(shù)為0.75～2.97、平均1.83±0.76，核/帽比值為0.714～2.468、平均1.60±0.58；MVD與易損指數(shù)及核/帽比值均呈正相關(guān)(r=0.728、0.739，P均<0.05)，見圖5。

2.3 斑塊內(nèi)不成熟血管MVD與斑塊易損性 未干預(yù)組腹主動脈斑塊CD31和α-SMA雙標(biāo)記免疫熒光染色(圖6)顯示，斑塊內(nèi)不成熟血管的平均MVD為(78.25±15.84)條/視野，成熟血管平均MVD為(15.67±4.56)條/視野。未干預(yù)組腹主動脈斑塊內(nèi)不成熟血管MVD與斑塊易損指數(shù)及核/帽比值均呈正相關(guān)(r=0.732、0.680，P均<0.05)，而其內(nèi)成熟血管MVD與斑塊易損指數(shù)及核/帽比值無明顯相關(guān)(P均>0.05)，見圖7。

2.4 超聲聯(lián)合微泡選擇性破壞斑塊內(nèi)不成熟微血管 實(shí)驗(yàn)組超聲聯(lián)合微泡治療后24 h，斑塊內(nèi)不成熟血管MVD相比未干預(yù)組減少(P<0.05)，2組間成熟血管MVD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖8；治療后8周，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量顯著增加，巨噬細(xì)胞含量和MVD均減少(t=-9.82、5.78、9.12，P均<0.05)，斑塊易損指數(shù)及核/帽比值降低(t=11.81、6.33，P均<0.05)。見圖9、10。

各組小鼠心、肝、腎及肺組織均未見出血、梗死及炎癥浸潤等異常表現(xiàn)。

3 討論

本研究制備的脂質(zhì)微泡性狀穩(wěn)定，用于小鼠實(shí)驗(yàn)的微泡均為新鮮制備；庫爾特粒徑分布圖結(jié)果顯示微泡平均粒徑約2.16 μm，約99%的微泡直徑<7 μm，其中可能含有部分納米級微泡，經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后可順利通過肺部毛細(xì)血管網(wǎng)而進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，并通過易損斑塊的新生滋養(yǎng)血管進(jìn)入動脈斑塊內(nèi)；實(shí)驗(yàn)過程中無小鼠死亡，且其心、肝、腎、肺組織內(nèi)未見出血、梗死及炎癥浸潤等表現(xiàn)，與既往報道[2]相符，提示所用微泡制備方法安全、可行。

超聲介導(dǎo)微泡破壞可引起空化效應(yīng)，超聲聲壓是決定慣性空化的重要參數(shù)之一[2]。微泡介導(dǎo)的超聲空化強(qiáng)度與血管損傷呈正相關(guān)[9]。超聲聯(lián)合微泡治療后，不成熟血管的密度隨超聲波增加而逐漸減少，超聲能量增大至3.0 MPa時，新生血管大部分被破壞，而對于正常組織無顯著影響[2,5,10]。本研究以超聲能量3.0 MPa的超聲聯(lián)合微泡進(jìn)行治療，治療后24 h，相比與未干預(yù)組，實(shí)驗(yàn)組腹主動脈斑塊不成熟血管MVD減少，而正常成熟血管MVD無明顯差異。分析原因，主要在于大部分斑塊中的MVD為未成熟血管，其結(jié)構(gòu)異常，內(nèi)皮間隙增大，基底膜存在缺陷，周細(xì)胞覆蓋率低[1,11-12]，使其對超聲聯(lián)合微泡的空化效應(yīng)高度敏感，而成熟血管則相對不敏感[13]。

本研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合微泡治療后8周，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組腹主動脈斑塊巨噬細(xì)胞含量減少、平滑肌細(xì)胞含量升高、易損指數(shù)和核/帽比值降低，提示超聲聯(lián)合微泡可選擇性有效破壞斑塊內(nèi)不成熟血管、提高斑塊穩(wěn)定性。單次超聲聯(lián)合微泡治療后，殘留的斑塊內(nèi)新生血管仍可導(dǎo)致紅細(xì)胞外滲，可能是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的因素之一[11,14]。超聲聯(lián)合微泡多次治療破壞動脈斑塊血管生成效果尚待進(jìn)一步觀察。

本研究的局限性：①動物實(shí)驗(yàn)研究，且樣本量??；②所用微泡為非靶向微泡，以靶向新生血管的微泡可能更易實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，有待后續(xù)觀察。

綜上，超聲聯(lián)合微泡可選擇性破壞小鼠腹主動不穩(wěn)定斑塊內(nèi)不成熟血管，改善斑塊不穩(wěn)定性。