李旭華 王鈺瑩 李 騰 盛 望

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410000； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長(zhǎng)沙，410208； 3 湖南省瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，瀏陽，410300)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為記憶力下降及認(rèn)知功能減退，又稱為老年性癡呆。隨著人口老齡化的嚴(yán)重，AD的發(fā)病率不斷上升，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，AD已成為老年患者死亡的第3位主要原因，僅次于腫瘤及心血管疾病[1]，給患者及其家庭帶來沉重的精神、經(jīng)濟(jì)和生活負(fù)擔(dān)。本病發(fā)病機(jī)制眾說紛紜，如乙酰膽堿水平低、β淀粉樣蛋白(β-amyloid Peptide，Aβ)沉積、Tau蛋白異常磷酸化聚集、氧化應(yīng)激等[2]，然而具體機(jī)制尚不明確，目前臨床所用藥物只能緩解癥狀，難以有效延緩疾病進(jìn)展。因此，防治AD成為當(dāng)今老年疾病研究領(lǐng)域最重要的前沿課題之一。

中醫(yī)講究整體觀念，主張辨證論治，在延緩AD患者病情進(jìn)展、提高患者生命質(zhì)量方面有較多優(yōu)勢(shì)。既往研究表明，補(bǔ)腎填精益髓方、健胃腦愈湯、健腦益智湯、補(bǔ)腎填髓方等中藥湯劑能有效提高AD患者的認(rèn)知功能和行為能力[3-6]。本研究通過觀察滋腎醒腦湯對(duì)AD大鼠模型海馬組織中Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響，探討滋腎醒腦湯對(duì)大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制，旨在為中醫(yī)藥治療AD提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)SD(Sprague Dawley)雄性大鼠，32只，6周齡，體質(zhì)量250～280 g/只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK(湘)]提供，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，室溫在22～24 ℃，自然光照，明暗交替各12 h，給予充足的清潔水、普通大鼠飼料30 g/(只·24 h)，并記錄每天平均每只大鼠的攝食量，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。本實(shí)驗(yàn)研究符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的基本要求，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理中心審查(倫理審批號(hào)：LLBH-202101060004)。

1.1.2 藥物 滋腎醒腦湯組成：生地黃24 g、熟地黃24 g、山茱萸12 g、法半夏9 g、陳皮10 g、石菖蒲15 g、益智仁10 g、川芎12 g、丹參20 g、當(dāng)歸10 g、茯苓20 g、紅景天20 g、竹瀝10 g、地龍10 g。上述中藥飲片均于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購買，采用自動(dòng)煎藥壺煎藥，2次煎汁混合后置于水浴鍋內(nèi)蒸發(fā)濃縮至含生藥比為2.5 g/mL，4 ℃冰箱保存。鹽酸多奈哌齊片(0.4 g/粒)(衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1907012)，臨用時(shí)用生理鹽水配成混懸液。

1.1.3 試劑與儀器 β淀粉樣蛋白25-35(Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：A4559-1MG)，用滅菌生理鹽水配置為10 μg/μL溶液，37 ℃環(huán)境孵育1周，4 ℃保存；兔抗Caspase-3抗體(Abcam公司，英國(guó)，批號(hào)：ab2302)；兔抗Caspase-9抗體(Abcam公司，英國(guó)，批號(hào)：ab52298)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9018)；二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PV-9000)；10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，批號(hào)：HT2384)、4%多聚甲醛(湖北江民泰華化工有限公司，批號(hào)：P1110)；蘇木精、伊紅(Wellbio公司，美國(guó)，批號(hào)：WB03008)；水迷宮系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司，型號(hào)：WMT-100S)；石蠟切片機(jī)(浙江金華益迪試驗(yàn)器材，型號(hào)：YD-315)；顯微成像系統(tǒng)[中國(guó)麥克奧迪(廈門)電氣股份有限公司，Motic BA210T]等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參照沈玉先等[7]方法制備AD模型，用水合氯醛(10%，3 mL/kg)將大鼠腹腔麻醉后固定于立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，參照大鼠腦立體定向圖譜，選取兩側(cè)海馬CA1為注射區(qū)，大致在前囟后3.0 mm，中線旁2.0 mm，顱骨下3.0 mm處，用電鉆鉆一骨窗后垂直于腦表面垂直進(jìn)針，用微量泵以0.4 μL/min的注射速度均勻注入1 μL Aβ25-35溶液，留針5 min，使溶液充分彌散，緩慢撤針，然后清潔并縫合皮膚，常規(guī)飼養(yǎng)。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組。模型組大鼠制備AD大鼠模型，造模后第4天，將造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成陽性對(duì)照組、中藥組。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)注射等體積生理鹽水，其余操作同模型組。

1.2.2 給藥方法 術(shù)后第2天起，陽性對(duì)照組、中藥組每天分別予以鹽酸多奈哌齊混懸液(0.45 mg/kg)、滋腎醒腦湯(18.54 mg/kg)灌胃，模型組和假手術(shù)組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)給藥4周，每組保證6只符合要求納入實(shí)驗(yàn)。末次灌胃2 h后取材。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 Morris水迷宮測(cè)試：采用Morris水迷宮法檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[7]。采用空間探索和定位航行試驗(yàn)，前5 d記錄大鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)，進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)能力的評(píng)定；第6天撤除目標(biāo)平臺(tái)，測(cè)量大鼠2 min內(nèi)跨越原目標(biāo)平臺(tái)的次數(shù)以及在目標(biāo)象限停留的時(shí)間，進(jìn)行大鼠記憶能力的評(píng)定。

1.2.4 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色觀察腦組織病理學(xué)切片 取大鼠前囟后1.0～1.5 mm區(qū)域做5 μm厚的冠狀切片，二甲苯中脫蠟，無水乙醇脫水，乙醇梯度水化，蘇木精染色10 min后蒸餾水沖洗，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Solution，PBS)返藍(lán)，1%伊紅復(fù)染3 min后蒸餾水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后封片。染色后，通過光學(xué)顯微鏡觀察每只大鼠海馬區(qū)腦組織病理學(xué)變化。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬區(qū)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá) 將石蠟切片置于恒溫箱中烘烤2 h，脫蠟至水，浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原熱修復(fù)20 min，冷卻后PBS(pH 7.2～7.6)洗滌；滴加一抗(Caspase-3、Caspase-9)，37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，PBS沖洗；加入二抗(50～100 μL抗-兔，兔-IgG抗體-HRP多聚體)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗；滴加二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)工作液顯色，蒸餾水沖洗；蘇木精復(fù)染10 min，蒸餾水沖洗；透明，封片。檢測(cè)并記錄：于每張切片海馬區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野(×400)，采用圖像分析軟件IPP(Image-Pro-Plus)測(cè)定光密度(Optical Density，IOD)，統(tǒng)計(jì)分析采用平均光密度(IOD/area)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果判斷以黃色或棕黃色為陽性染色。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè) 分析定位導(dǎo)航試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠逃避潛伏期(Escape Latency，EL)逐漸縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；訓(xùn)練第1天和第2天，各組大鼠EL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；從第3天開始，模型組大鼠EL較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)；至第4天，與模型組比較，中藥組及陽性對(duì)照組EL均明顯縮短(P<0.05或P<0.01)。分析大鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡雜亂，經(jīng)過跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，且目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短(P<0.05)；中藥組及陽性對(duì)照組較假手術(shù)組跨越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且運(yùn)動(dòng)軌跡逐漸趨向規(guī)則。見表1～2。

2.2 HE染色檢測(cè)腦組織病理學(xué)變化 光鏡下觀察大鼠梗死側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞病理學(xué)變化，假手術(shù)組細(xì)胞排列規(guī)整，結(jié)構(gòu)完整而清晰；模型組神經(jīng)元細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，胞核出現(xiàn)皺縮、破裂以及空腔等現(xiàn)象，可見部分死亡神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少；中藥組和陽性對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列情況均較模型組好轉(zhuǎn)。見圖1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期

表2 各組大鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)比較(HE染色，×400)

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬區(qū)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá) 假手術(shù)組Caspase-3、Caspase-9見少量表達(dá)，模型組、中藥組和陽性對(duì)照組Caspase-3、Caspase-9均高于假手術(shù)組(均P<0.05)，造模成功。中藥組和陽性對(duì)照組Caspase-3、Caspase-9表達(dá)較模型組弱(均P<0.05)，中藥組與陽性對(duì)照組Caspase-3、Caspase-9表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Caspase-3、Caspase-9蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2～3，平均光密度見表3。

表3 各組大鼠Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)平均光密度值

3 討論

在中醫(yī)學(xué)中，AD歸屬于“癡呆”“虛勞”“健忘”“呆病”等范疇?！鹅`樞》曰：“腦為髓之海。”《素問·五藏生成》云：“諸髓者，皆屬于腦?！币蚰X為元神之府，總統(tǒng)諸神，故AD病位主要在腦?！豆茏印に亍吩唬骸澳I生腦?！惫势浒l(fā)病與腎密切關(guān)系。清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)·腦髓說》云：“高年無記性者，腦髓漸空，年老氣血不足，腦髓失養(yǎng)，發(fā)為癡呆?！盇D主要發(fā)生在老年人，因腦為髓之海，腎藏精，主骨生髓通腦，故腎臟生精而髓海得充，腦方能正常發(fā)揮其功能。若年老腎精虧虛，髓海不足，腦失充養(yǎng)，加之精神刺激及瘀血、痰濁等實(shí)性病機(jī)的夾雜，最終發(fā)為虛實(shí)夾雜的神志疾病。湖南名老中醫(yī)藥專家胡國(guó)恒教授提出“腎腦同治”的治法，擬滋腎醒腦湯補(bǔ)腎生髓、活血化痰，方中生地黃、熟地黃、山茱萸補(bǔ)腎益精填髓，如此腦髓充則精明之腑有所養(yǎng)；法半夏、茯苓、石菖蒲化痰開竅；當(dāng)歸、川芎、丹參、紅景天活血化瘀；竹瀝、地龍豁痰通絡(luò)。全方共奏補(bǔ)腎填精、活血化痰、醒腦開竅之效。

既往研究表明，細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)后可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，其首要因素是激活Caspase[8-10]，說明Caspase家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Caspase-9和Caspase-3是Caspase家族成員，正常情況下以無活性的酶原存在，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號(hào)發(fā)出后，二者在內(nèi)源性凋亡的調(diào)控中扮演重要作用，Caspase-9是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中重要起始因子，被認(rèn)為是內(nèi)源性凋亡途徑的“執(zhí)行者”；而Caspase-3作為凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的下游凋亡因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，被認(rèn)為是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡真正的“實(shí)施者”，被稱為“死亡蛋白酶”[11-13]。Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用[14]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的3條誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路(線粒體/細(xì)胞色素C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路)均在Caspase-3處會(huì)合，激活下游底物，通過裂解肌動(dòng)蛋白、膜收縮蛋白、角蛋白等，使細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，呈現(xiàn)凋亡的共同特點(diǎn)[15-16]。Caspase家族激活在許多腦缺血再灌注模型中都可以觀察到，其表達(dá)越高，腦梗死越明顯[17]，而Caspase基因敲除或應(yīng)用Caspase抑制劑時(shí)腦梗死的體積明顯縮小[18-19]，體外模型同樣發(fā)現(xiàn)，對(duì)于氧糖剝奪(Oxygen-Glucose Deprivation，OGD)模型，Caspase-3基因缺失的神經(jīng)元較正常神經(jīng)元耐受力強(qiáng)[20]。這說明Caspase-3使細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，細(xì)胞死亡增多。因此檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中-9和-3的表達(dá)水平能在一定程度上反映細(xì)胞凋亡的程度。

圖2 各組大鼠腦組織(海馬區(qū))Caspase-3比較(免疫組織化學(xué)染色，×400)

圖3 各組大鼠腦組織(海馬區(qū))Caspase-9比較(免疫組織化學(xué)染色，×400)

本研究結(jié)果顯示，較假手術(shù)組相比，模型組大鼠雙側(cè)海馬經(jīng)側(cè)腦室注入Aβ25-35后，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短，出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶能力下降，表明造模成功。HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列規(guī)整，模型組神經(jīng)元細(xì)胞損傷嚴(yán)重，而中藥組和陽性對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況均較模型組減輕。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，模型組、中藥組和陽性對(duì)照組-3、-9均高于假手術(shù)組(P<0.05)，說明造模成功，中藥組和陽性對(duì)照組-3、-9表達(dá)較模型組弱均(P<0.05)。

綜上所述，本研究通過水迷宮實(shí)驗(yàn)、HE染色、免疫組織化學(xué)等檢驗(yàn)方式，證明滋腎醒腦湯對(duì)于改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與下調(diào)AD大鼠海馬組織中-3、-9蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，從而減少細(xì)胞凋亡，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。