謝佳 顏永毅 龔輝成

作為一種來(lái)源于鼻黏膜上皮組織的良性腫瘤，鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（NIP）有鮮明的臨床特點(diǎn)，即易侵蝕破壞周圍組織、術(shù)后易復(fù)發(fā)、有癌變傾向。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率為0.03%～0.84%，在鼻腔鼻竇乳頭狀瘤中約占70%，在全部鼻部腫瘤中占0.5%～4.0%，超過(guò)10%的NIP 可能會(huì)發(fā)生癌變。Holm 等在研究NIP 的發(fā)病因素時(shí)發(fā)現(xiàn)1984 至2014 年NIP 發(fā)病率上升了7.6%。絕大多數(shù)學(xué)者在研究NIP 起病相關(guān)因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，HPV 感染與NIP發(fā)生、進(jìn)展有著極大關(guān)系。國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于HPV 與NIP 發(fā)生發(fā)展關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道，但以往報(bào)道的相關(guān)研究樣本量相對(duì)較少，缺乏代表性，且樣本中HPV 檢出率在0%～86%，檢測(cè)結(jié)果大相徑庭，故HPV 與NIP 的關(guān)系成為當(dāng)下臨床研究關(guān)注的重點(diǎn)。筆者團(tuán)隊(duì)將在本次實(shí)驗(yàn)中分析HPV 在NIP 中的感染情況，并且運(yùn)用核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片分型技術(shù)（HybriMax）檢測(cè)NIP 中的HPV 亞型，為進(jìn)一步研究 HPV 介導(dǎo)NIP 發(fā)病、復(fù)發(fā)及惡變機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

選取廣州市第十二人民醫(yī)院住院患者的石蠟包埋存檔組織標(biāo)本，2010 至2019 年48 例經(jīng)病理確診為NIP （男32 例，女16 例，中位年齡52.2 歲）患者的石蠟包埋組織標(biāo)本作為NIP 實(shí)驗(yàn)組；另取同期20 例因鼻中隔偏曲行鼻中隔矯正患者術(shù)中所取鼻中隔切口邊緣黏膜組織的石蠟包埋標(biāo)本（男11 例，女9 例，中位年齡45 歲）作為正常鼻黏膜對(duì)照組；所有入組患者均在本院耳鼻咽喉頭頸外科住院治療，在只給予手術(shù)治療尚未給予放射治療、化學(xué)治療、IFN 治療、免疫治療等措施的條件下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，并排除其他系統(tǒng)的惡性腫瘤。

二、HE 及免疫組織化學(xué)（組化）染色

NIP 實(shí)驗(yàn)組48 例石蠟標(biāo)本及正常鼻黏膜對(duì)照組20 例石蠟標(biāo)本均經(jīng)過(guò)10%中性福爾馬林溶液固定、脫水及石蠟包埋。

1.常規(guī)病理制片

①切片：將每例石蠟標(biāo)本作4 μm 厚的連續(xù)切片4 張；②展片、貼片：在40～45 ℃的水面上，用鑷子將蠟片平鋪于水面并充分展平，將蠟片貼于載玻片上，載玻片預(yù)先涂上0.05%多聚賴氨酸；③烤片：將蠟片放在烤箱中，溫度設(shè)置為60 ℃，時(shí)間設(shè)置為0.5～1 h；④脫蠟：使用二甲苯、不同濃度乙醇進(jìn)行脫蠟；⑤染色：進(jìn)行HE 及免疫組化染色，根據(jù)試劑盒具體做法進(jìn)行操作（4 張切片中，2 張切片行目的蛋白免疫組化染色、1 張切片行HE 染色、剩下1 張切片則用于設(shè)置空白對(duì)照）。

2.判斷標(biāo)準(zhǔn)

在400 倍顯微鏡下，選取5 個(gè)視野，需遵循隨機(jī)取樣原則，觀察5 個(gè)視野中的細(xì)胞染色情況。①根據(jù)5 個(gè)視野中觀察到的染色細(xì)胞平均百分比記分： 0%～10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、超過(guò)76%。分別記為1 分、2 分、3 分、4分、5 分。②根據(jù)5 個(gè)視野中觀察到的細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：未著色、淡黃色、黃色、棕黃色，分別記為0 級(jí)、1 級(jí)、2 級(jí)、3 級(jí)。③最終判定：根據(jù)①、②結(jié)果的乘積判定，＜ 3 為（-），定義為陰 性 表 達(dá)；3～6 為（+）、7～9 為（++）、10～12 為（+++），均定義為陽(yáng)性表達(dá)。病理切片的觀察、結(jié)果讀取及記錄由2 位醫(yī)師負(fù)責(zé)，由符合資質(zhì)的病理科醫(yī)師進(jìn)行最終審核。

三、運(yùn)用HybriMax 檢測(cè)HPV 病毒分型檢測(cè)

1.材料準(zhǔn)備

將NIP 實(shí)驗(yàn)組中的48 例石蠟標(biāo)本及正常鼻黏膜對(duì)照組中的20 例石蠟標(biāo)本隨機(jī)進(jìn)行排列，從每個(gè)標(biāo)本上連續(xù)切下3 片石蠟組織，厚度均為10 μm，并將切下的石蠟組織放入干凈研缽。

在研缽中加入適量液氮后充分研磨，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA 的提取。

PCR 總反應(yīng)體積為25 μL，其中含有PCR premix 23.25 μL、Taq 酶0.75 μL、不同標(biāo)本的HPV DNA 1 μL，并設(shè)置蒸餾水作為HPV 陰性對(duì)照，在PCR 儀上設(shè)置好反應(yīng)程序，循環(huán)次數(shù)為40 次。

將低密度基因芯片放入導(dǎo)流雜交儀中，芯片標(biāo)記有21 種常見(jiàn)HPV 寡核苷酸探針（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304），根據(jù)試劑盒具體做法進(jìn)行操作，酶標(biāo)顯色。以上全過(guò)程需進(jìn)行無(wú)菌操作。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0。計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，計(jì)數(shù)資料比較采用檢驗(yàn)，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HPV 在NIP 實(shí)驗(yàn)組與正常鼻黏膜對(duì)照組中的感染情況

NIP 實(shí)驗(yàn)組與正常鼻黏膜對(duì)照組HPV 感染情況見(jiàn)表1。

表1 NIP 實(shí)驗(yàn)組與正常鼻黏膜對(duì)照組HPV 感染情況（例）

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NIP 實(shí)驗(yàn)組與正常鼻黏膜對(duì)照組的中位年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞ 0.05）。NIP 實(shí)驗(yàn)組組織標(biāo)本中HPV 總陽(yáng)性率為64.58%（31/48），正常鼻黏膜對(duì)照組組織標(biāo)本中HPV 陽(yáng)性率為0（0/20），NIP 陽(yáng)性率高于正常鼻黏膜對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （= 32.178，P ＜ 0.01）。

二、HPV 亞型在NIP 實(shí)驗(yàn)組石蠟標(biāo)本中的分布情況

在48 例NIP 標(biāo)本中，31 例檢測(cè)出HPV，其中檢測(cè)出49 株HPV 病毒，含括12 個(gè)亞型：HPV6占4.08%（2/49）、HPV11 占32.65%（16/49）、HPV16 占12.24%（6/49）、HPV18 占4.08%（2/49）、HPV33 占4.08%（2/49）、HPV39 占2.04%（1/49）、HPV44 占10.20%（5/49）、HPV52 占8.16%（4/49）、HPV53 占2.04%（1/49）、HPV56 占2.04%（1/49）、HPV58 占16.30%（8/49）、HPV68 占2.04%（1/49）。

討 論

NIP 是一種良性腫瘤， 發(fā)生于鼻黏膜上皮組織，鑒于其易侵蝕破壞周圍組織、術(shù)后易復(fù)發(fā)、有癌變傾向等的顯著特點(diǎn)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其是一種交界性腫瘤，各研究中NIP 有較高的復(fù)發(fā)率及惡變率，其中復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～78%，且惡變率可達(dá)5%～21%。NIP 的發(fā)病因素尚未完全清楚，雖然NIP 患病人群中以中老年男性患者居多，但并無(wú)相關(guān)研究明確年齡、性別與NIP 發(fā)病的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外許多研究在NIP 標(biāo)本中檢測(cè)出HPV，認(rèn)為NIP的發(fā)病與HPV 感染存在密切關(guān)系，但受取樣、不同檢測(cè)方法、不同地區(qū)及其他因素影響導(dǎo)致檢出率差異性較大。目前，HPV 介導(dǎo)NIP 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，且NIP 惡變機(jī)制也未明了，在判斷NIP 是否會(huì)發(fā)生惡變及如何有效地降低其復(fù)發(fā)率等方面研究也有所欠缺。

HPV 是一種雙鏈閉環(huán)DNA 病毒，其致病途徑是通過(guò)感染人體表皮和黏膜鱗狀上皮，研究表明HPV 亞型至今已有200 種，可根據(jù)HPV 亞型致病力及致癌力2 個(gè)方面進(jìn)行比較，將HPV 亞型歸為兩類：低危型（HPV 6、11、40、42 等） 、高危型（HPV 16、18、31、33、35 等）。HPV 自 首 次發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直被認(rèn)為是手足尋常疣、扁平疣及尖銳濕疣的病因。經(jīng)后期大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受到某些病毒感染時(shí)易引起腫瘤發(fā)病，如EB 病毒與鼻咽癌，伯基特（Burkitt）淋巴瘤，肝炎病毒與肝癌，HPV 與宮頸癌等，使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注病毒與腫瘤發(fā)病之間的關(guān)系，研究表明高危型HPV 檢測(cè)對(duì)宮頸病變的檢出有重要意義。HPV 不僅與宮頸癌起病有明確關(guān)系，還與10%～15%其他部位腫瘤的發(fā)病有關(guān)聯(lián)，如陰道、陰莖、肛門(mén)等部位， HPV與乳腺癌、頭頸部腫瘤、食管癌、膀胱癌等之間也存在聯(lián)系。隨著病毒分子生物學(xué)的研究發(fā)展，對(duì)HPV 感染致病的研究已不再聚焦于宮頸疾病，HPV 與頭頸部腫瘤，特別是與NIP 的關(guān)系，也成為一項(xiàng)熱門(mén)研究。近年來(lái)，HPV 感染可引發(fā)頭頸部腫瘤這一結(jié)論得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。

在NIP 發(fā)病相關(guān)因素的研究中，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HPV 感染與NIP 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Syrjantn 等（1987 年）最先運(yùn)用原位DNA 雜交技術(shù)在NIP 中檢測(cè)出HPV DNA。此后，國(guó)內(nèi)外不斷出現(xiàn)有關(guān)HPV 感染與NIP 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究報(bào)道。Beck 等（1995 年）研究了32 例NIP 的病理標(biāo)本，應(yīng)用PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)有20 個(gè)標(biāo)本被檢出HPV 陽(yáng)性（20/32，62.5%），得出NIP 與HPV 感染有關(guān)的結(jié)論。McGovern 等報(bào) 道HPV 檢出率為76.2%（16/21）。包永新等對(duì)HPV16 與NIP進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NIP 中HPV16 陽(yáng)性率為62.5%，NIP 伴癌前病變中HPV16 陽(yáng)性率達(dá)66.7%，說(shuō)明在NIP 致病過(guò)程中HPV16 可能起到關(guān)鍵作用。關(guān)亞峰等運(yùn)用PCR 技術(shù)在NIP 中檢測(cè)出HPV57，陽(yáng)性率為78.3%，得出HPV57 可能與NIP 的發(fā)病密切相關(guān)。有研究表明NIP 同時(shí)合并2 種HPV 亞型感染率達(dá)17.5%，合并3 種HPV 亞型感染率達(dá)6.7%。趙仁伍等研究使用薈萃分析法證實(shí)了HPV 感染可以增加NIP 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，并可能在NIP 的復(fù)發(fā)中起到至關(guān)重要的作用。王茂華等用薈萃分析法進(jìn)一步驗(yàn)證了HPV 感染與NIP 的發(fā)生、復(fù)發(fā)及癌變相關(guān)。同時(shí)，有研究表明NIP 癌變中高危型HPV 感染率明顯高于復(fù)發(fā)及原發(fā)NIP，而NIP 復(fù)發(fā)中高危型HPV 感染率明顯高于原發(fā)NIP。Hwang 等（1998 年）應(yīng)用PCR 技術(shù) 對(duì)42例NIP 石蠟包埋組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)良性NIP 中有HPV6 和HPV11 擴(kuò)增，惡變NIP 中有HPV16 擴(kuò)增。有學(xué)者認(rèn)為HPV16、11/16、18、16/18 可以增加NIP 癌變的風(fēng)險(xiǎn)，而HPV6、11、6/11（尤其是HPV6）被認(rèn)為是NIP 復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。有學(xué)者研究表明，鱗狀上皮增生、角化過(guò)度、核分裂像增加是影響NIP 預(yù)后及復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。然而不少學(xué)者研究則表明HPV 感染與NIP 復(fù)發(fā)無(wú)明顯關(guān)系，故HPV 感染是否促進(jìn)了NIP 的復(fù)發(fā)仍然存在爭(zhēng)議。

本研究中針對(duì)NIP 中HPV 感染及表達(dá)情況，筆者團(tuán)隊(duì)運(yùn)用了HE、免疫組化染色及HybriMax，結(jié)果顯示在所有NIP 石蠟標(biāo)本中HPV 總陽(yáng)性率為64.58%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組的0。在48 例NIP 標(biāo)本中，檢測(cè)出49 株HPV 病毒，含括12 個(gè)亞型（HPV6、11、16、18、33、39、44、52、53、56、58、68），認(rèn)為HPV 感染與NIP 的發(fā)生有著密切關(guān)系，特別是HPV11、16、44、58 亞型。

綜上所述，國(guó)內(nèi)NIP 的發(fā)生發(fā)展與感染了HPV11、16、44、58 亞型的可能性最大，但HPV如何致癌的分子途徑尚未研究明白，有待深入研究。