張程杰

(1.田邊三菱制藥研發(fā)(北京)有限公司上海分公司，上海 200030；2.上海國廣生物科技有限公司，上海 201801)

L-茶氨酸(L-theanine, L-The)是一種非常重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，是茶葉中特有的氨基酸，屬酰胺類化合物，分子式為C7H14N2O2，占其總游離氨基酸50%以上[1]。L-The使茶葉有鮮美的味道和獨特的特色，其在茶葉中的含量會直接影響茶的質(zhì)量和價格。除了獨特的味道，L-The已被證明有許多有益的生理效果，尤其在促進人腦放松，提高注意力和促進學(xué)習(xí)能力方面有顯著的功效[2-3]。L-The已被FDA列為安全的食品藥品添加劑。根據(jù)數(shù)據(jù)表明，在2020年我國L-The產(chǎn)量高達700t左右，占據(jù)全球總產(chǎn)量的76%以上。隨著下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，以及L-The應(yīng)用技術(shù)的成熟，近幾年全球L-The市場需求持續(xù)攀升，行業(yè)得到快速發(fā)展，L-The的市場需求龐大，需要開發(fā)工業(yè)化生產(chǎn)L-The途徑和方法[4]。

目前，工業(yè)化生產(chǎn) L-The的主要方法有植物分離提取法、植物組織細胞培養(yǎng)法、化學(xué)合成法和微生物法。分離提取法生產(chǎn)L-The成本高，規(guī)模受到限制，且分離過程中使用大量的化學(xué)試劑，易造成環(huán)境污染。植物組織細胞培養(yǎng)法運行成本高，無法大規(guī)模推廣應(yīng)用?；瘜W(xué)合成法得到的是 L-構(gòu)型和 D-構(gòu)型的消旋體，需要進一步拆分得到 L-The，且反應(yīng)副產(chǎn)物多[5]。微生物法催化合成 L-The具有原料價格低廉，催化效率高，立體專一性強等優(yōu)點，具有大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的潛力[6]。但是目前報道的GMAS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-The的效率較低，導(dǎo)致L-The產(chǎn)量難以大幅度提高。L-The的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 L-The的化學(xué)結(jié)構(gòu)

GMAS是一種能夠催化L-谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，該反應(yīng)需要消耗ATP。同時GMAS也可以催化乙胺和L-谷氨酸合成L-The。1992年，Kimura等[7]從噬甲基菌株Methylophagasp.中純化出GMAS，該酶在pH 7.5和40℃條件下有最大活性，表現(xiàn)出較寬的底物特異性范圍，并能以乙胺和L-谷氨酸為底物催化合成L-The，但未進行深入研究。2019年，潘鑫茹等[8]報道共表達多聚磷酸鹽激酶(PPK)和GMAS的重組菌全細胞催化系統(tǒng)，建立ATP再生系統(tǒng)，強化 L-The的酶法合成。微生物發(fā)酵法具有培養(yǎng)條件簡單、周期短、操作簡便、綠色環(huán)保、原料及生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點，具有更加良好的工業(yè)應(yīng)用價值。本研究建立了GMAS的三維結(jié)構(gòu)，通過分子對接，開展GMAS的晶體結(jié)構(gòu)半理性設(shè)計，建立GMAS關(guān)鍵位點的飽和突變體庫，以提高GMAS對關(guān)鍵底物谷氨酸的催化效率。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

E.coliBL21(DE3)菌株，質(zhì)粒pETDuet-1為本實驗室保存。質(zhì)粒pETDuet-1-GMAS-PPK和基因工程菌BL21(DE3)/pETDuet-1-GMAS-PPK由本實驗室構(gòu)建。L-谷氨酸、乙胺和L-The均為分析純。

1.2 大腸桿菌合成L-The

將質(zhì)粒pETDuet-1-GMAS-PPK轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，構(gòu)建合成L-The的基因工程菌BL21(DE3)/pETDuet-1-GMAS-PPK。將單菌落接種到培養(yǎng)基中，待OD600達到0.5-0.6，加入1.0 mM IPTG, 5 g/L L-谷氨酸，5 g/L 乙胺鹽酸鹽，250 RPM, 30℃, 發(fā)酵48 h。

1.3 同源模建及分子對接

選擇源于Methyloversatilisuniversalis的GMAS的晶體結(jié)構(gòu)為模板，運用Swiss-Model服務(wù)器建立GMAS的三維模型。使用AutoDock4.2軟件進行分子對接。采用AutoDockTools程序簡歷格點盒子，格子長寬高位置為4 nm，間隔0.375?，采集128個構(gòu)象。通過拉馬克遺傳算法將全局和局部搜索的能量優(yōu)化結(jié)合，尋找配體與受體最佳結(jié)合位置，完成分子對接。采用PyMOL軟件分析對接后復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。

1.4 飽和突變文庫的構(gòu)建和篩選

基于GMAS一級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)分析，選擇在GMAS的E174位點進行飽和突變。設(shè)計含有簡并密碼子 NNK( N = A /T/C/G，K = G/T) 的引物，以重組質(zhì)粒pETDuet-1-GMAS-PPK為模板，利用PCR方法 (PCR反應(yīng)條件: 98℃變性60 s; 98℃預(yù)變性 30 s，55℃退火 15 s，72℃延伸7 min，30個循環(huán); 72℃充分延伸5 min; 16℃保存) 進行飽和突變以構(gòu)建突變文庫。通過Sanger公司(上海)測序，確定正確的突變體。挑取正確的轉(zhuǎn)化子接種到含有 2 mL LB液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，于 37℃，200 r/min 條件下培養(yǎng) 8 h 后，轉(zhuǎn)接至含有 10 mL LB 液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，37℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)至 OD600為 0. 6-0. 8，向培養(yǎng)基中添加0. 5 mM IPTG，不同濃度的L-谷氨酸和乙胺，于30℃，200 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 h。通過高效液相色譜法測定L-The產(chǎn)量。

1.5 分析方法

L-谷氨酸和L-The用高效液相色譜法進行定性和定量分析。衍生劑采用苯異硫酸酯[9]，XDB-C18柱，操作溫度40℃，流速1.0 mL/min， 檢測波長254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMAS與L-谷氨酸的模建結(jié)構(gòu)與分子對接

位于酶底物結(jié)合口袋附近的氨基酸突變通常會在一定程度上影響酶的空間結(jié)構(gòu)、電荷分布及疏水性，從而影響酶的催化活性和底物專一性等催化特性[10]。選取Methyloversatilisuniversalis的GMAS的晶體結(jié)構(gòu)為模板建立了 GMAS 的三維模型，并將底物對接到建立好的三維模型中，對接結(jié)果見圖2。結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)表明，GMAS的底物結(jié)合口袋相對保守，推測口袋內(nèi)識別底物谷氨酸和乙胺的關(guān)鍵氨基酸殘基為E174。通過在線服務(wù)器SWISS-MODEL對GMAS中缺失的結(jié)構(gòu)進行同源模建補全，然后進行分子對接。GMAS與L-谷氨酸的模建結(jié)構(gòu)與分子對接結(jié)果見圖2。

圖2 GMAS與L-谷氨酸的模建結(jié)構(gòu)與分子對接

2.2 E174位點飽和突變對合成L-茶氨酸的影響

利用含有簡并密碼子的引物進行E174位點飽和突變以構(gòu)建突變文庫，獲得了庫容20 株的突變文庫。結(jié)果顯示，突變體E174A、E174R、E174C、E174E和E174S與野生型E174在L-The產(chǎn)量上無顯著性差別，而突變體E174A和E174G在L-The產(chǎn)量上相較野生型，提高了19%和24%。搖瓶發(fā)酵24 h，L-The產(chǎn)量達到1.71 g/L和1.78 g/L(圖3)。其他飽和突變體導(dǎo)致L-The產(chǎn)量現(xiàn)在下降。E174A和E174G這兩個突變體明顯提高了L-The在大腸桿菌中的合成能力，實現(xiàn)了L-The產(chǎn)量的大幅提高。

圖3 突變體E174A和E174G提高大腸桿菌L-The產(chǎn)量

3 討論

L-The是茶樹中最具代表性的非蛋白氨基酸，是茶葉的鮮味成分之一，有助于茶的獨特風(fēng)味。由于其多種保健功能，L-The已被商業(yè)開發(fā)為一種有價值的成分，被廣泛用作食品補充劑和添加到藥物、保健品和化妝品中。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-The具有一步完成反應(yīng)、原料價格低廉、容易從反應(yīng)液中提取獲得產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化效率高、可大量生產(chǎn)等特點，因此，采用微生物發(fā)酵法是實現(xiàn)L-The規(guī)模化生產(chǎn)的潛在優(yōu)勢途徑。為了提高GMAS的在大腸桿菌中的表現(xiàn)，過表達構(gòu)建的GMAS的 E174 位點飽和突變體，希望獲得在大腸桿菌胞內(nèi)表現(xiàn)更好的GMAS，經(jīng)過發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn) GMAS (E174A) 和GMAS (E174G)的點突變，顯著提高了大腸桿菌合成L-The的產(chǎn)量，這證明了 E174位點對 GMAS 的重要性。