李瑤璐，陳小芳，李國(guó)坤，丁靜華，蘇立杰，陳驍熠

（廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 511436）

槲皮素（Quercetin）是一種天然黃酮類化合物，作為功能性食品的主要成分之一，槲皮素生理功能廣泛，具有抗氧化［1］、抗炎［2］、降糖［3］、降壓［4，5］等作用［6，7］。槲皮素對(duì)腸道菌群有調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)宿主恢復(fù)微生物平衡，還具有保護(hù)腸屏障的作用［8］，通過(guò)抑制腸道細(xì)菌的產(chǎn)生降低炎癥反應(yīng)。已有研究［9］證實(shí)槲皮素治療能降低高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的C57BL/6J 小鼠的血糖，具有較好的抗氧化作用，對(duì)于調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平具有重要意義。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明［10-12］槲皮素能增加腸道菌群的種類，上調(diào)腸道中有益菌群的豐度，抑制致病菌的生長(zhǎng)，因此槲皮素具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。

代糖是一種甜味高、能量低甚至不含能量的蔗糖替代糖，本研究選用復(fù)配代糖，由赤蘚糖醇［13］、菊粉［14］、甜菊糖苷［15］、羅漢果苷組成，均為天然甜味劑且是無(wú)糖產(chǎn)品的絕佳選擇［16］，具有潤(rùn)腸通便和改善腸道菌群紊亂［17-20］、促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌生長(zhǎng)的作用［21］。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，此復(fù)配代糖GI 值為 0，且能調(diào)節(jié)特定人群的腸道菌群［22，23］。

綜上所述，槲皮素和代糖均能降低血糖負(fù)荷且能調(diào)節(jié)腸道菌群，對(duì)糖尿病的預(yù)防控制具有重要意義。而酸奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、更易于人體消化吸收，因此本研究將槲皮素與代糖結(jié)合，研發(fā)一款可供特殊人群食用的槲皮素代糖酸奶，并探究槲皮素和代糖對(duì)酸奶菌群的影響及其對(duì)腸道菌群體外增殖的影響，豐富酸奶的種類，也為乳制品和低血糖負(fù)荷的功能食品生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；代糖，廣州萊品健康科技有限公司復(fù)配糖（產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào) ：GB 26687—2011，生 產(chǎn) 許 可 證 編 號(hào) ：SC1244419014023）；脫脂乳粉，澳大利亞施普特乳制品私有公司；酸奶發(fā)酵劑，安琪酸奶發(fā)酵劑（12 菌型）；KF 鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌選擇培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；小鼠糞便，SPF 級(jí)健康Balb/c 小鼠由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物室。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B 型微機(jī)生化培養(yǎng)箱，上海瑞豐儀器儀表有限公司；LS-35HD 型高壓蒸汽滅菌機(jī)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；G6 型迅數(shù)自動(dòng)菌落分析儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；Multiskan GO 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 加工工藝流程 槲皮素代糖酸奶加工工藝流程如圖1 所示，具體如下。

圖1 槲皮素代糖酸奶加工工藝流程

1）器皿消毒。將酸奶瓶、奶盆、稱量匙、分裝勺等器皿放入高壓滅菌鍋里滅菌備用，溫度、時(shí)間設(shè)定為 121 ℃、20 min。

2）復(fù)原乳的制備。稱取事先計(jì)算好的脫脂奶粉重量，用70～80 ℃溫開(kāi)水按相應(yīng)比例溶解，制成復(fù)原乳備用。

3）配料。按配方的相應(yīng)比例，添加復(fù)合代糖、明膠溶液（需先分出一小部分水將明膠溶解完），充分混勻。

4）滅菌。將上述混合液于高壓滅菌鍋內(nèi)，95 ℃下持續(xù)滅菌5～10 min。

5）冷卻、接種。滅菌完迅速降溫至40 ℃左右，然后接種提前活化的菌種。

6）發(fā)酵。接種完的乳液需置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，溫度設(shè)定為40 ℃，直到凝乳塊形成。

7）加入槲皮素、破乳。在發(fā)酵好的酸乳中按比例加入槲皮素，攪拌至顏色和組織均勻。

8）后熟。當(dāng)酸乳溫度冷卻至10 ℃時(shí)，置于冰箱中后熟24 h，溫度為4～6 ℃。

1.3.2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 由20 人組成感官品評(píng)小組，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)酸奶進(jìn)行評(píng)分，取平均值作為總分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］見(jiàn)表1。

表1 槲皮素代糖酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 工藝配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察發(fā)酵時(shí)間、乳粉添加量、代糖添加量和發(fā)酵劑接種量對(duì)槲皮素代糖酸奶感官評(píng)分和酸度的影響。

1）工藝配方單因素試驗(yàn)。以100 mL 乳液為基準(zhǔn)，探究當(dāng)槲皮素添加量0.1%、明膠0.2%，發(fā)酵溫度42 ℃時(shí)，乳粉添加量、代糖添加量、發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵時(shí)間4 種單因素對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響，確定最佳工藝配方。發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為6、7、8、9、10 h；乳粉添加量分別設(shè)定為10%、12%、14%、16%、18%；代糖添加量分別設(shè)定為5%、6%、7%、8%、9%；發(fā)酵劑接種量分別設(shè)定為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。

2）工藝配方優(yōu)化正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以槲皮素代糖酸奶的感官評(píng)價(jià)和酸度為考察指標(biāo)，選取發(fā)酵時(shí)間、復(fù)合代糖添加量、發(fā)酵劑接種量3 個(gè)因素設(shè)計(jì) 3 因素 3 水平正交試驗(yàn)（表 2），優(yōu)化發(fā)酵工藝。

表2 槲皮素代糖酸奶優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 槲皮素及代糖對(duì)酸奶乳酸菌及理化性質(zhì)的影響 原味酸奶與槲皮素代糖酸奶的檢測(cè)指標(biāo)均參考GB 19302—2010 進(jìn)行檢測(cè)，乳酸菌總數(shù)按照GB 4789.35—2016、脂肪按照 GB 5009.6—2016、蛋白質(zhì)按照 GB 5009.5—2016、酸度按照 GB 5009.239—2016 要求進(jìn)行檢測(cè)，微生物限量按照GB 19302—2010 進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 槲皮素代糖酸奶對(duì)小鼠腸道菌群的影響 基于《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003 年版）》，探討最佳配方酸奶對(duì)小鼠部分腸道菌群的影響。選取腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌作為研究對(duì)象。取無(wú)菌動(dòng)物房小鼠糞便，稀釋至10-4濃度后，分別接種于4 種選擇培養(yǎng)基上，腸球菌、腸桿菌（36±1）℃培養(yǎng)24 h、雙歧桿菌和乳酸桿菌（36±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h 后，選擇性培養(yǎng)并鑒定，剔除不符合條件的菌落，其余菌落以無(wú)菌水沖洗后收集，得到目標(biāo)菌種。將0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊哪繕?biāo)菌種以10%的接種量接種于含有適量槲皮素代糖酸奶和普通酸奶的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，取 200 μL 置于 96 孔板中，腸球菌、腸桿菌37 ℃培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。以空白營(yíng)養(yǎng)肉湯為對(duì)照，分別做3 個(gè)平行樣，于600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度（OD）。每2 h 測(cè)定1次，共檢測(cè)24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響 由表3 和圖2 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，不同發(fā)酵時(shí)間的酸奶之間感官評(píng)價(jià)分值有顯著差異（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，分?jǐn)?shù)先升高再稍微降低，酸度均在合格范圍內(nèi)（GB 19302—2010），且酸度均大于70°T，因此最適發(fā)酵時(shí)間在9 h 左右。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響

表3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度的影響

2.1.2 乳粉添加量對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響由表4 和圖3 可知，乳粉添加量為10%時(shí)，酸奶酸度不符合國(guó)標(biāo)規(guī)定。隨著乳粉添加量的增加，酸奶感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)隨著乳粉添加量的增加而增加，且酸度均在 70°T 以上。因感官評(píng)分總體在85～95 分，差距并不明顯，綜合考慮酸奶品質(zhì)和口感及試驗(yàn)?zāi)康模醪酱_定乳粉添加量為最高值18%。

表4 乳粉添加量對(duì)酸度的影響

圖3 乳粉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.3 代糖添加量對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響由表5 和圖4 可知，代糖添加量為5%時(shí)，酸度小于70°T 不符合國(guó)標(biāo)規(guī)定。隨著代糖添加量的增加，酸奶的感官評(píng)分先升高后降低，且酸度均大于70 °T，因此最適的代糖添加量在7%左右。

圖4 代糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

表5 代糖添加量對(duì)酸度的影響

2.1.4 發(fā)酵劑接種量對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響 由表6 和圖5 可知，隨著發(fā)酵劑接種量的增加，酸奶的感官評(píng)分先增加后降低，且酸度均在合格范圍之內(nèi)，因此最適宜的發(fā)酵劑接種量在0.15%左右。

圖5 發(fā)酵劑接種量對(duì)感官評(píng)分的影響

表6 發(fā)酵劑接種量對(duì)酸度的影響

2.2 正交試驗(yàn)

由表7 可知，根據(jù)正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果可看出，各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響存在差異，各因素對(duì)酸奶的影響大小依次為代糖添加量＞發(fā)酵劑添加量＞發(fā)酵時(shí)間，極差分析結(jié)果表明最優(yōu)方案為A3B2C1，即代糖添加量7% ，發(fā)酵時(shí)間10 h，發(fā)酵劑添加量0.10%，感官評(píng)分及酸度分別為86.45 分和75.83°T，酸度符合國(guó)標(biāo)規(guī)定。

表7 槲皮素代糖酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 理化指標(biāo)

經(jīng)檢測(cè)，優(yōu)化后的槲皮素代糖酸奶蛋白質(zhì)含量為 2.14 g/100 g，脂肪含量為0.1 g/100 g，酸度為80.56 °T，葡萄糖含量為 0.072 mg/mL，蔗糖含量為0.781 mg/mL，乳糖含量為1.098 mg/mL。大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌均未檢出。

2.4 槲皮素代糖酸奶的乳酸菌總數(shù)

由表8 可知，槲皮素代糖酸奶中乳酸菌總數(shù)為（2.612±0.005）×108CFU/mL，原味酸奶中乳酸菌總數(shù)為（1.356±0.006）×108CFU/mL，P＜0.05，說(shuō)明槲皮素代糖酸奶的乳酸菌總數(shù)顯著高于原味酸奶的乳酸菌總數(shù)。

表8 槲皮素代糖酸奶乳酸菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.5 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸道菌群體外增殖的影響

2.5.1 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸球菌體外增殖的影響由圖6 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組的OD均高于空白組，整個(gè)生長(zhǎng)曲線的趨勢(shì)與空白組基本一致。在8 h 后槲皮素代糖酸奶相比原味酸奶抑制了腸球菌的增殖生長(zhǎng)，14 h 后隨時(shí)間的延長(zhǎng)只有小幅度的增長(zhǎng)。槲皮素代糖酸奶組腸球菌生長(zhǎng)曲線明顯低于原味酸奶組腸球菌，表明槲皮素代糖酸奶對(duì)腸球菌的增殖表現(xiàn)出抑制作用。

圖6 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸球菌增殖的影響

2.5.2 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸桿菌體外增殖的影響由圖7 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組腸桿菌的生長(zhǎng)曲線發(fā)展趨勢(shì)與空白組基本一致，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，槲皮素代糖酸奶組呈小幅度的增長(zhǎng)，在18 h 后呈下降趨勢(shì)，且槲皮素代糖酸奶組腸桿菌的生長(zhǎng)曲線多數(shù)在原味酸奶組之下，表明槲皮素代糖酸奶對(duì)腸桿菌有一定的增殖抑制作用。

圖7 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸桿菌增殖的影響

2.5.3 槲皮素代糖酸奶對(duì)雙歧桿菌體外增殖的影響 由圖8 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)與空白組基本一致，細(xì)菌懸液OD隨時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，原味酸奶組和槲皮素代糖酸奶組雙歧桿菌的生長(zhǎng)曲線都在空白組之上，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組的雙歧桿菌OD均高于原味酸奶組。槲皮素代糖酸奶組不僅在8 h 后加速雙歧桿菌的增殖，并且在20 h 后仍有促進(jìn)作用，明顯提高雙歧桿菌的最終濃度，表現(xiàn)出較強(qiáng)的扶植作用。

圖8 槲皮素代糖酸奶對(duì)雙歧桿菌增殖的影響

2.5.4 槲皮素代糖酸奶對(duì)乳酸桿菌體外增殖的影響 由圖9 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)比空白組增長(zhǎng)迅速，槲皮素代糖組乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線高于原味組乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線，且2 h 時(shí)就表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，可以明顯提高乳酸桿菌的OD，說(shuō)明槲皮素代糖酸奶能夠更好促進(jìn)乳酸桿菌的增殖。

圖9 槲皮素代糖酸奶對(duì)乳酸桿菌體外增殖的影響

3 小結(jié)

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定槲皮素代糖酸奶的最佳工藝配方為乳粉添加量18%，代糖添加量7%，發(fā)酵時(shí)間10 h，發(fā)酵劑添加量0.10%；與原味酸奶相比，槲皮素代糖酸奶的乳酸菌總數(shù)較高；24 h 生長(zhǎng)曲線動(dòng)態(tài)觀察槲皮素代糖酸奶對(duì)小鼠腸道菌群在體外增殖的影響發(fā)現(xiàn)其能明顯促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖、抑制腸桿菌和腸球菌的增殖。槲皮素代糖酸奶不僅滿足特殊人群的需求，且具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，為乳制品和低血糖負(fù)荷的功能食品生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。