茍秋鳳，代富英，曹 康，謝擁軍，潘 渠

成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院 病原生物學教研室(成都 610500)

全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)從1977年發(fā)展至今，已成為一種快速、低成本獲取生物體全基因組的方法[1]。WGS可發(fā)現(xiàn)基因組變異，在微生物的分類鑒定中應用廣泛[2]。WGS經(jīng)歷了三代技術(shù)革新，二代測序和三代測序的結(jié)合已成為目前最廣泛的雜交測序方法[3-4]。雜交測序一方面使用長讀長跨越重復序列或缺口，另一方面使用短讀長糾正測序中錯誤的堿基[5]。GenBank數(shù)據(jù)庫中完成WGS的菌株越來越多，用傳統(tǒng)的DNA文庫或PCR擴增的方法無法獲得的質(zhì)?？捎蒞GS數(shù)據(jù)進行組裝，但組裝質(zhì)粒的正確性和完整性需要進一步鑒定和分析。從WGS中準確識別染色體序列和質(zhì)粒序列是質(zhì)粒鑒定分析的先決條件[6]。WGS可獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒序列，但很多組裝質(zhì)粒并不一定真實存在，質(zhì)粒的組裝仍存在較多問題，且尚未被解決，需改良WGS后的組裝。本文對WGS技術(shù)的發(fā)展、WGS后質(zhì)粒的組裝、質(zhì)粒的鑒定及質(zhì)粒組裝中存在的問題進行綜述。

1 WGS的發(fā)展

第一代測序技術(shù)以Sanger等[1]提出的鏈終止法及Maxam等[7]提出的鏈降解法為標志。Sanger測序使用4種帶有熒光標記的2′, 3′-二脫氧胸腺嘧啶三磷酸(2′, 3′-dideoxythymidine-5′-triphosphate，ddTTP)。在DNA合成中，因ddTTP在2′, 3′上不含羥基不能形成磷酸二脂鍵，特定在含胸苷酸的位置終止，阻止鏈的延伸；在DNA反應體系中分別加入4種帶有同位素熒光標記的ddTTP，在凝膠電泳顯影后，其條帶的位置可確定DNA序列[8]。1977年噬菌體phiX174使用Sanger測序法完成了基因組測序[8]。Sanger測序依賴于使用DNA聚合酶，在受控條件下轉(zhuǎn)錄DNA的特定區(qū)域，需要模板、引物及電泳分離產(chǎn)品，其特點為通量低，不適用于長片段測序。

第二代測序也稱下一代測序，以瑞氏Roche公司的454測序、美國Illumina公司的Solexa/HiSeq測序和美國ABI公司的SOLiD系統(tǒng)高通量測序為標志[9]。Illumina測序技術(shù)采用合成測序技術(shù)，將帶有固定接頭的文庫變性為單鏈并移植到流動槽上，然后進行橋接擴增，形成含有克隆DNA片段的簇。測序前文庫借助線性化酶連接成單鏈，然后用含有不同熒光、可移除保護基團的4種堿基補充模板，用電荷耦合器捕獲信號、分析數(shù)據(jù)[9]。Illumina測序技術(shù)主導第二代測序市場，測序速度快、成本低，其讀長正確率高達99.9%，但長度只有100～300 bp[3,10-11]，導致許多基因組被分割成數(shù)百個或數(shù)千個讀長；而基因組包含許多長讀長的重復序列，短讀長導致片段化組裝或缺口，無法正確測重復序列，組裝的連續(xù)性較差[4,11-12]。二代測序依賴于PCR，而PCR擴增GC%極值區(qū)的效率低[11]，準確測序GC%極值區(qū)難度較大。

第三代測序以美國PacBio公司的單分子實時測序(single-molecule real-time sequencing，SMRT)和納米孔測序(oxford nanopore technologies sequencing，ONT)的長讀長測序技術(shù)為標志[13]。SMRT對單個DNA分子實時測序，通過SMRTbell(一種閉合的單鏈環(huán)狀DNA)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接模板DNA,進入到芯片SMRTcell的最小測序單元ZMW中。ZMW底部固定的聚合酶與SMRTbell結(jié)合并開始復制，SMRTcell中4種不同熒光標記的核苷酸被結(jié)合時產(chǎn)生可識別的光脈沖數(shù)據(jù)即可進行分析[14]。SMRT比大多數(shù)測序方法更快，平均讀長>10 kb，但單次測序堿基錯誤率較高[15]，通過多次測序可降低錯誤率，但受聚合酶活性限制，讀長和測序次數(shù)相互影響。SMRT吞吐量較低，1個SMRTcell中有150 000個ZMW，但只有35 000～70 000個ZMW可成功產(chǎn)生讀長。SMRT體積龐大，需要大量的初始投資，適用于大型測序中心，因測序成本較高導致使用受限[4, 14]。ONT在流動槽中進行，流動槽中的2個離子溶液被含有納米孔的膜隔開，當DNA經(jīng)過納米孔時,通過發(fā)生的電導率變化來識別DNA堿基，最后利用軟件進行數(shù)據(jù)處理，完成數(shù)據(jù)采集和分析[13, 16]。ONT通量高且快速，讀長的長度不受技術(shù)本身限制，與受測DNA分子長度有關，如果DNA質(zhì)量足夠，可獲得高達1 Mb的讀長。ONT的讀長錯誤率比SMRT高[4, 11]，但新的文庫制備技術(shù)和堿基識別算法的錯誤率可降至12%[17]。ONT體積小且便宜，初始投資低，可在預防疾控中心進行快速測序，便于診斷[4]。SMRT和ONT的共同特征為產(chǎn)生長讀長，不需要引物和PCR擴增，減少或消除PCR擴增帶來的測序偏差。長讀長可跨過短讀長在重復序列和高GC%含量區(qū)產(chǎn)生缺口[18]，提高基因組裝配的連續(xù)性，但由于較高的堿基錯誤率，需要在組裝前或組裝后使用短讀長校正組裝[19]。

生物體通過WGS可獲得全部基因組信息。Pareek等[20-21]對人類和模式生物體進行WGS分析發(fā)現(xiàn)，基因組有多種變異類型，例如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)、拷貝數(shù)變異、復合物重排等。WGS可監(jiān)測癌癥基因突變，探索其功能或臨床意義[22-23]。微生物的WGS結(jié)果通過與已測菌株的序列比對，可發(fā)現(xiàn)新生物或鑒定特定的細菌生物。宏基因組測序也是一種快速檢測和發(fā)現(xiàn)新物種的測序方法，其基因組數(shù)據(jù)來自同一物種，不是單一的菌株，不需要對微生物分離和純化。已測序的宏基因組中包含許多未被鑒定的質(zhì)粒序列，從宏基因組數(shù)據(jù)中組裝質(zhì)粒計算量大且費時、費力[24]。細菌病原體的WGS具有流行病學監(jiān)測的潛力[25]。

2 WGS后質(zhì)粒的組裝

WGS后質(zhì)粒的組裝程序根據(jù)貪婪法、重疊布局共識(overlap-layout-consensus，OLC)、de Bruijn圖和字符串圖的不同算法來組裝序列[26]。二代測序的短讀長采用DBG進行組裝，而SMRT和ONT采用適用于長讀長組裝的OLC方法。MinION和SMRT產(chǎn)生的讀長用Falcon、Miniasm、Hybrid等組裝程序組裝發(fā)現(xiàn),SMRT讀長組裝的錯配數(shù)更少，精確度明顯高于MinION，但組裝程序?qū)畚?TTTTT、AAAAA、CCCCC和GGGGG)識別較差[4]。使用Illumina短讀長和ONT長讀長的聯(lián)合組裝(Unicycler)可充分利用二者優(yōu)勢，拼接富含質(zhì)粒的細菌基因組，組裝更大的重疊群[27]。Unicycler對WGS后質(zhì)粒的組裝包括7步：1)使用高準確度的Illumina短讀長進行組裝，設置k-mer值構(gòu)建重疊群[28]，去除深度<50%DBG的重疊群，消除大多數(shù)污染序列；2)貪婪法使用測序深度和連接信息確定重疊群的多重性，將多重性分配給染色體重疊群之外的高拷貝數(shù)質(zhì)粒重疊群；3)通過構(gòu)建短讀長的搭橋連接成對的單拷貝重疊群，配對末端，短讀長可解析小重復序列；4)長讀長的搭橋,與多個單拷貝重疊群比對的長讀長可用于橋接，長讀長可解析更大的重復序列，橋接序列來自2個連續(xù)序列之間的圖，而不是長讀長，可提高序列的準確性，當存在多個橋接路徑時，根據(jù)與長讀長一致序列選擇最佳搭橋路徑；5)橋的應用，Unicycler為每一個橋分配了質(zhì)量分數(shù)，并按質(zhì)量遞減順序應用橋，確保當存在多個矛盾的橋時，使用最佳匹配的選項；6)刪除已在橋中使用且不提供額外連接信息的重疊群，將橋合并形成大的重疊群，再使用TBLASTN搜索dnaA或repA等位基因[29]，使其開始于正鏈上編碼的基因，降低基因在序列開始和結(jié)束處斷開的風險；7)使用短讀長對重疊群進行校正，降低不匹配率[30]。使用Unicycler組裝得到的質(zhì)粒，準確度由Illumina短讀長的準確度決定，可有效避免ONT長讀長拆分錯誤引入的序列污染，最后利用二代短讀長數(shù)據(jù)對組裝質(zhì)粒進行糾錯，得到準確度高的基因組。

3 WGS后質(zhì)粒的鑒定

WGS獲得大量片段化的質(zhì)粒讀長，通過對其組裝和解讀，進一步分析質(zhì)粒序列特征，了解菌株的生物學特性。隨著WGS技術(shù)的發(fā)展，GenBank數(shù)據(jù)庫中產(chǎn)生許多測序后組裝的質(zhì)粒，然而組裝質(zhì)粒并沒有得到鑒定和分析，分析質(zhì)粒序列仍具有挑戰(zhàn)性。鑒定質(zhì)粒的方法可分為2種[31]：1)從測序讀長或組裝圖中重建整個質(zhì)粒序列，如Recycler、PlasmidSPAdes、PLANCET[32-34]；2)通過鑒定或驗證組裝的重疊群是否來自質(zhì)?！，F(xiàn)有鑒定重疊群是否來自質(zhì)粒的預測程序可分為3種[35]：1)通過標記基因搜索的方法，如搜索序列中復制子的PlasmidFinder[36]；2)基于質(zhì)粒和染色體序列的基因組特征的方法，如根據(jù)質(zhì)粒序列和染色體序列的k-mer頻率的cBar、Plasmidseeker、Mlplasmids、PlasFlow[37-40]；3)基于讀長深度和GC%含量特征鑒定質(zhì)粒[41]。

Carattoli等[36]利用PlasmidFinder對559個質(zhì)粒序列進行鑒定，成功識別263個質(zhì)粒。PlasmidFinder是依據(jù)參考復制子來鑒定質(zhì)粒序列，因此無法鑒定與參考質(zhì)粒序列無明顯相似性的新型質(zhì)粒[33]。Zhou等[37]根據(jù)五聚體頻率的差異,使用cBar程序從881個完全測序的原核生物基因組中區(qū)分染色體序列和質(zhì)粒序列，分類準確度為92%。Roosaare等[38]用Plasmidseeker對8 514個質(zhì)粒序列進行檢測，發(fā)現(xiàn)其靈敏度達100.00%，特異性為99.98%，但無法檢測拷貝數(shù)低且與參考質(zhì)粒相似性低的質(zhì)粒。研究[42]顯示,質(zhì)粒檢測的敏感性cBar最高(87.45%)，其次是PlasmidSPAdes(81.49%)和PlasmidFinder(36.47%)。但另一項研究[40]表明，cBar錯誤預測其他序列為質(zhì)粒序列(假陽性)的錯誤率達6.46%。在一項148個參考質(zhì)粒的鑒定案例中，PlasmidSPAdes正確預測了125個質(zhì)粒，cBar正確預測了84個質(zhì)粒，Recycler正確預測了21個質(zhì)粒，PlasmidFinder正確預測了13個質(zhì)粒[31]。綜上，質(zhì)粒的組裝或鑒定工具的檢測能力有明顯差異，無法正確檢測質(zhì)粒，WGS裝配工具的精度有待進一步提高。

4 WGS后質(zhì)粒組裝存在的問題

在一項對植物乳桿菌PC518菌株進行WGS發(fā)現(xiàn)，通過全質(zhì)粒組測序和PCR擴增全序列的方法鑒定了WGS后的組裝質(zhì)粒[43]。PCR擴增結(jié)果顯示，大質(zhì)粒只能被擴增出一段序列，并非真實存在的質(zhì)粒(假陽性質(zhì)粒)，表明大質(zhì)粒序列中可能出現(xiàn)染色體序列或其他質(zhì)粒序列的錯誤識別并被組裝到1個質(zhì)粒上。WGS和全質(zhì)粒組測序的2次測序均組裝出序列一致的大質(zhì)粒，表明染色體序列和質(zhì)粒序列仍難正確區(qū)分[42]。在WGS和全質(zhì)粒組測序中有部分堿基不同的組裝質(zhì)粒，表明WGS中存在錯誤測序的堿基。在全質(zhì)粒組測序中出現(xiàn)1個WGS中未發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗證是1個完整的質(zhì)粒。經(jīng)過BLAST比對分析發(fā)現(xiàn),該質(zhì)粒被錯誤組裝在WGS的大質(zhì)粒上，WGS中出現(xiàn)假陰性質(zhì)粒。WGS未能正確組裝出質(zhì)粒的重復序列，當基因組序列中有高度重復序列區(qū)、插入序列、極端GC%含量或不同的甲基化模型時，短讀長會產(chǎn)生不正確的組裝[44-45]。

從WGS數(shù)據(jù)中鑒定質(zhì)?；蛉旧w的序列是一大挑戰(zhàn)，然而質(zhì)粒重疊群的合并比其鑒別更困難[41]，短讀長測序無法解析重復元件，導致每個基因組產(chǎn)生數(shù)百個重疊群[34]。有研究[18]描述WGS后基因組組裝中遇到的問題：利用短讀長組裝無法解決rRNA的長串聯(lián)拷貝、其他串聯(lián)重復序列和高GC%含量的區(qū)域(90%～100%)引起的問題。質(zhì)粒組裝過程中存在多種重復：質(zhì)粒內(nèi)重復是指質(zhì)粒內(nèi)的重復；質(zhì)粒間重復是指由多個質(zhì)粒共享的重復；共享重復是指在質(zhì)粒和染色體之間共享的重復[46]。這些重復序列可以是2個或數(shù)百萬個拷貝，用短讀長測序技術(shù)難以解決。短讀長測序產(chǎn)生數(shù)百個染色體和質(zhì)粒重疊群組成的片段組合，短讀長從頭組裝，導致片段化組裝和錯誤組裝[39]。Arredondo-Alonso等[31]研究表明，長片段測序可幫助染色體和染色體外序列的解析。長讀長測序雖可改善基因組組裝的連續(xù)性問題，提高重復序列的裝配質(zhì)量，但仍有較多的插入或缺失難以檢測和糾正[42]。

隨著Illumina測序技術(shù)不斷增長，在同一流動池中，對多個樣本同時測序變得越來越普遍。每個樣本使用索引，然后在相同的流動池中一起測序，因存在一些混合的可能性，其中基因組DNA讀取被分配到錯誤的索引，從而被分配到錯誤的樣本中[47]。這些污染序列來自其他DNA樣本的交叉污染，或是用于測序的DNA樣本中的細菌污染，或是測序中特意引入用于質(zhì)量控制的噬菌體DNA。污染序列影響下游數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，導致序列錯誤組裝，去除污染序列是所有測序項目的標準質(zhì)量控制。利用BLAST與參考基因比對，排除污染序列，其速度慢且參考基因的空白或基因組中結(jié)構(gòu)變異均可出現(xiàn)假陽性結(jié)果[48]。當一個樣本被不同基因型的DNA污染時，得到不同單核苷酸多態(tài)性等位基因比率，然后通過篩選對污染序列進行識別和定量[49]。污染序列隨著測序深度增加而減少，因此提高測序深度可降低污染序列的影響[50]。

由于一些質(zhì)粒不包含任何明顯的質(zhì)?；?，質(zhì)粒逃避檢測或因質(zhì)?？截悢?shù)與染色體相似，可預測出假陰性質(zhì)粒。一些錯誤分類的染色體重疊群作為質(zhì)粒來源，或非質(zhì)粒的環(huán)鏈被報告為質(zhì)粒[42,46]。因受到染色體序列的污染，質(zhì)粒預測通常是不完整的，在預測的質(zhì)粒中經(jīng)常存在染色體衍生的重疊群[39]。因重復序列的存在，在區(qū)分染色體序列和質(zhì)粒序列方面仍存在一定問題[42]。質(zhì)粒常攜帶重復元件，組裝質(zhì)粒與其他質(zhì)粒和微生物基因組有共享基因[32]，細菌基因組中頻繁出現(xiàn)的插入序列和轉(zhuǎn)座元件阻止了質(zhì)粒的完整組裝。

5 展望

WGS后質(zhì)粒的組裝和鑒定是一項艱巨的任務,SMRT和ONT具有很大的發(fā)展?jié)摿?，然而堿基的高錯誤率對正確組裝質(zhì)粒序列提出挑戰(zhàn)。組裝質(zhì)粒獲得有利于質(zhì)粒工具的發(fā)展，但這些組裝質(zhì)粒存在錯誤組裝、假陽性質(zhì)粒、假陰性質(zhì)粒的問題。WGS后質(zhì)粒組裝的精度需要專業(yè)技術(shù)人員參與，更新組裝軟件，改良WGS后的質(zhì)粒組裝。