江 舸，朱恒怡，謝 華，常艷波，吳 強(qiáng)△

1.四川省藥品檢驗(yàn)研究院 化學(xué)藥品所(成都 610097)；2.四川省藥品檢驗(yàn)研究院 生物樣本檢測(cè)中心(成都 610097)；3.四川省藥品檢驗(yàn)研究院 業(yè)務(wù)科(成都 610097)

愈酚噴托異丙嗪顆粒(sulfogaiacol pentoxyverine and promethazine granules，SPPG)用于感冒或流感引起的咳嗽、咳痰，可用于小兒下呼吸道感染[1]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]中規(guī)定，處方中胭脂紅的含量為0.15 g/kg。胭脂紅的加入有助于改善兒童用藥的順應(yīng)性，同時(shí)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中原輔料是否混合均勻有提示作用，但胭脂紅屬于偶氮類色素[3],偶氮化合物在體內(nèi)可代謝生成親電子產(chǎn)物，它與DNA和RNA結(jié)合可形成加合物而誘發(fā)突變[4]，同時(shí)胭脂紅可被氧化產(chǎn)生自由基,從而造成DNA氧化損傷[5]，因此有必要控制該制劑中胭脂紅的加入量，保證產(chǎn)品安全性。

目前，國(guó)內(nèi)外在食品行業(yè)對(duì)色素有一套較為完善的控制體系，其檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和電化學(xué)方法等[6-7]。SPPG的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均未收載胭脂紅的檢查項(xiàng)，考慮到該制劑中可能會(huì)使用其他紅色色素代替胭脂紅使用，因此建立了一種前處理簡(jiǎn)單、凈化效果好、分析速度快、回收率高的胭脂紅及其他常用紅色色素定量分析方法，同時(shí)對(duì)6種色素進(jìn)行檢測(cè),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

ACQUITY超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Empower2工作站(美國(guó)Waters公司)；HSS T3色譜柱(美國(guó)Waters公司，50 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；CPA255D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Mill-Q Advantage A10超純水儀(德國(guó)Merck Millipore公司)；PWAX SPE小柱(規(guī)格：150 mg/6 mL,美國(guó)Agela Technologies公司)；胭脂紅對(duì)照品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)40726，含量98.0%)、日落黃對(duì)照品[中國(guó)計(jì)量科學(xué)院，批號(hào)GBW(E)100003a，50 g/L]、新紅對(duì)照品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)30523，含量89.0%)、莧菜紅對(duì)照品(中檢院，批號(hào)510002-201401，含量87.4%)、誘惑紅對(duì)照品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)30523，含量100%)、偶氮玉紅對(duì)照品(Dr.Ehrenstorfer，批號(hào)40725，含量92.0%)。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。132批SPPG為國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，來(lái)源于12家生產(chǎn)企業(yè)。

1.2 色譜條件

以HSS T3(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)為色譜柱；流動(dòng)相A為10 mmol/L磷酸二氫銨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫(表1)；流速為0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取胭脂紅對(duì)照品118.90 mg、日落黃對(duì)照品50 mg、新紅對(duì)照品13.85 mg、誘惑紅對(duì)照品20.09 mg、偶氮玉紅對(duì)照品23.28 mg、莧菜紅對(duì)照品20.90 mg，分別置于100、100、10、10、10、10 mL容量瓶中，加水溶解,并稀釋至刻度，搖勻，即得上述6種色素的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取日落黃對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL、新紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL、胭脂紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL、誘惑紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05 mL、偶氮玉紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05 mL、莧菜紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05 mL，置同一10 mL容量瓶中，加入氨水-甲醇(1∶9,v/v)1.8 mL，混勻，加水稀釋至刻度，搖勻。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取研細(xì)的樣品約5 g，精密加水10 mL使溶解，待凈化；將PWAX SPE小柱用6 mL甲醇和6 mL水活化后，上樣，依次加入6 mL水和6 mL甲醇淋洗，然后用氨水-甲醇(1∶9,v/v)9 mL洗脫，洗脫液加水稀釋至50 mL，經(jīng)10 000 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.4 定量方法

精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有與6個(gè)色素化合物峰保留時(shí)間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

取空白陰性原輔料(處方中除胭脂紅外的輔料及原料)約5 g，按照“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液前處理方法制得空白陰性原輔料溶液，取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件實(shí)驗(yàn)，結(jié)果空白陰性原輔料溶液不影響6個(gè)色素化合物的測(cè)定，且6個(gè)色素化合物峰之間的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)均>7 000(圖1)。

圖1 專屬性色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取“1.3.1”項(xiàng)下胭脂紅、日落黃、新紅、誘惑紅、偶氮玉紅、莧菜紅對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量，加入氨水-甲醇(1∶9,v/v)適量使其占配制溶液總體積的18%，加水稀釋制成每1 mL中約含上述各色素1、5、10、20、40 μg的系列對(duì)照品溶液，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，胭脂紅回歸方程為y=2.04×104x-5.27×103，R2為1.000 0；日落黃回歸方程為y=2.35×104x-5.06×103，R2為0.999 9；新紅回歸方程為y=2.28×104x-6.97×103，R2為0.999 9；誘惑紅回歸方程為y=2.10×104x-5.15×103，R2為0.999 3；偶氮玉紅回歸方程為y=1.29×104x-4.95×103，R2為0.999 7；莧菜紅回歸方程為y=2.69×104x-5.78×103，R2為0.999 9。

2.3 檢出限與定量限

精密量取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用水逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，分別以S/N為3和10作為檢測(cè)限和定量限，結(jié)果胭脂紅、日落黃、新紅、誘惑紅、莧菜紅檢測(cè)限為0.012 μg/L、定量限為0.038 μg/L，偶氮玉紅檢測(cè)限為0.021 μg/L、定量限為0.067 μg/L。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，6個(gè)色素化合物色譜峰面積RSD(n=6)均<0.35%，保留時(shí)間RSD(n=6)均<0.15%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批次(批號(hào)：161006)研細(xì)的樣品6份，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定6個(gè)色素的含量，計(jì)算得胭脂紅平均含量為0.16 g/kg，RSD為0.28%(n=6)，日落黃、新紅、莧菜紅、誘惑紅、偶氮玉紅均未檢出。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

稱取空白陰性原輔料約5 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，分別精密加入“1.3.1”項(xiàng)下日落黃對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL、新紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL、胭脂紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL、誘惑紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05 mL、偶氮玉紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05 mL、莧菜紅對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，按照“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行前處理，平行做6份，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定并計(jì)算回收率，胭脂紅、日落黃、新紅、誘惑紅、偶氮玉紅、莧菜紅的平均回收率分別為99.6%(RSD=0.6%)、100.2%(RSD=0.2%)、100.6%(RSD=0.5%)、99.8%(RSD=0.3%)、97.8%(RSD=0.7%)、98.5%(RSD=0.8%)。

2.7 樣品測(cè)定

按照擬定的6種色素含量測(cè)定方法對(duì)收集到的132批樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果12家生產(chǎn)企業(yè)中僅3家企業(yè)按照色素胭脂紅的處方量0.15 g/kg進(jìn)行投料，9家企業(yè)未按照處方量進(jìn)行投料，且均低于胭脂紅處方量投料(圖2)，各生產(chǎn)企業(yè)樣品中均未檢出另外5種紅色色素。

圖2 132批樣品中胭脂紅含量分布圖

3 討論

有文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道，非法染色的中藥材及中藥飲片、食品中多種色素的檢測(cè)方法較多見(jiàn)，但化學(xué)藥品中作為藥用輔料色素的分析方法卻很罕見(jiàn)。本方法采用固相萃取-超高效液相色譜法測(cè)定SPPG中的6種紅色合成色素，前處理方法簡(jiǎn)單，4 min即可完成6種色素的分離及定量分析，提高了實(shí)驗(yàn)室工作效率。

精密稱取研細(xì)的樣品適量，直接用水溶解后進(jìn)樣，未檢測(cè)到6個(gè)色素化合物峰，推測(cè)是處方中蔗糖(956 g/kg)的大量存在干擾了色素的檢出，采用固相萃取技術(shù)能有效除去樣品中的蔗糖，且萃取后的溶液中存在的其他成分均不影響色素的分離檢出。對(duì)收集到的132批樣品全部進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次的樣品中胭脂紅含量無(wú)較大差異，且均未發(fā)現(xiàn)使用其余5種紅色色素替代胭脂紅投料的情況。12家生產(chǎn)企業(yè)中有9家企業(yè)未按照胭脂紅的處方量進(jìn)行投料，其中有4家企業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品中胭脂紅的投料量不足處方規(guī)定量的一半，存在未按處方生產(chǎn)的情況。SPPG可供兒童使用，兒童的肝腎功能還不健全，處方中使用的合成色素胭脂紅可能對(duì)兒童身體造成一定損害。英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局2007年公布的一份研究報(bào)告[11]顯示，兒童在飲用了含有胭脂紅的飲料后，可能會(huì)出現(xiàn)行為沖動(dòng)、注意力不集中等癥狀，且偶氮類色素體內(nèi)代謝后存在致突變、致畸的可能。目前未查詢到相關(guān)法規(guī)規(guī)定色素作為輔料在藥品中的最大允許使用量，因此有必要進(jìn)一步加大合成色素的毒理研究，制定出藥品中胭脂紅科學(xué)合理的處方用量，并采用本方法進(jìn)行質(zhì)量控制，保障兒童安全用藥。

綜上所述，該方法不僅可作為SPPG的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，同時(shí)也可為其他藥物中添加的紅色色素測(cè)定提供參考方法和思路。