王昱嘉 陳德盛 袁如意 鐘永浩 劉曉宇

深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東深圳 518060

腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae）屬于粉螨科（Acaridae），食酪螨屬（Tyrophagus）[1]。其是常見的儲藏物滋生螨，其尸體、皮殼、代謝產(chǎn)物和排泄物等會污染儲存的食品[2]。人在接觸、吸入甚至食用其滋生物后，可能會受到腐食酪螨的侵襲，引發(fā)人體螨病[3-4]。研究報道，腐食酪螨作為一種過敏原，能夠引發(fā)遺傳體質(zhì)者發(fā)生由IgE介導(dǎo)產(chǎn)生的過敏反應(yīng)，引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病[5]，如皮炎、過敏性鼻炎和過敏性哮喘等[6]。腐食酪螨分布廣泛，對人類的正常生活和健康造成嚴(yán)重的影響，是繼屋塵螨、粉塵螨后又一重要致敏螨種[7]。過敏原Tyr p 34（原名為Tyr p 24）由IgE篩選克隆取得，其含有153個氨基酸，相對分子質(zhì)量為17.7 kDa。本實(shí)驗(yàn)對Tyr p 34重組蛋白進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化，并對其進(jìn)行過敏原鑒定，這將有助于腐食酪螨過敏性疾病患者的特異性診治，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與表達(dá)載體 大腸桿菌Rosetta（DE3）與表達(dá)載體pET-28a為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，能夠有效結(jié)合并表達(dá)腐食酪螨重組蛋白Tyr p 34。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I（生工生物工程股份有限公司）；RNA提取試劑（QIAGEN，奧格生物技術(shù)有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（生工生物工程股份有限公司）；Ni-NTA resin及柱子（Amersham Pharmacia公司）。Western blot所用血清采集自深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院，經(jīng)過敏原測試診斷為腐食酪螨過敏患者。血清采集均獲得患者知情同意，所有血樣標(biāo)本的獲取均得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的認(rèn)可。

1.2 方法

1.2.1 腐食酪螨RNA的提取 選取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的活腐食酪螨，在液氮中浸泡、研磨，使用RNA提取試劑盒提取其總RNA。

1.2.2 擴(kuò)增Tyr p 34基因 以提取的腐食酪螨的總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到腐食酪螨的全部cDNA。根據(jù)已知Tyr p 34序列設(shè)計(jì)特異性引物，上下游引物分別為5’-GACCTTCGAGGAGAACGACC-3’；5’-TGGTAGGCAGGTTGGTAGGT-3’。根 據(jù)引物和cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃加熱變性1 min，55℃冷卻復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共進(jìn)行30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物連接至克隆載體，再將此重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coil Top10，在固體LB平板進(jìn)行涂布過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。待達(dá)到生長指數(shù)階段時取樣測序。

1.2.3 構(gòu)建Tyr p 34重組表達(dá)菌 將得到的正確序列的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a分別用BamH I及Xho I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coil Top10中，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Rosetta（DE3）中，放入梯度擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，涂板倒置過夜培養(yǎng)，待表面生長出白色微小圓形菌落，用封口膜密封后放進(jìn)冰箱保存。

1.2.4 Tyr p 34少量誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白鑒定 挑取單個菌落接種在含有Kana抗生素的LB培養(yǎng)基中，以37℃、150 rpm過夜振蕩培養(yǎng)。取1 ml菌液，離心取其沉淀，標(biāo)記為誘導(dǎo)前菌。向兩個含有Kana的LB培養(yǎng)基中各加入2 ml菌液，分別標(biāo)記為低溫組（16℃）以及高溫組（37℃）。取余下菌液進(jìn)行保菌。將高溫組及低溫組放入37℃搖床中振蕩培養(yǎng)（150 rpm、4 h），當(dāng)細(xì)菌生長至對數(shù)生長期（OD600為0.6～0.8時），各加入終濃度為1 mol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。低溫組誘導(dǎo)表達(dá)條件為16℃、125 rpm、20 h；高溫組誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃、150 rpm、4 h，誘導(dǎo)表達(dá)成功后離心收集沉淀表達(dá)菌。經(jīng)PBS裂解、冰浴超聲波破碎、4℃離心后，收集得到低溫組及高溫組的上清、沉淀。將誘導(dǎo)前菌、低溫組及高溫組的上清、沉淀依次排列，沉淀重懸、加入上樣緩沖液，沸水浴10 min后離心，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察蛋白的主要存在形式，發(fā)現(xiàn)Tyr p 34蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在，在高溫組中含量相對較多。

1.2.5 重組蛋白Tyr p 34大量表達(dá)及純化 取200 μl少量表達(dá)所保菌接種于含有Kana的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（37℃、150 rpm）。次日取50 ml菌液接種于1 L含有Kana的LB培養(yǎng)基中，放入37℃搖床中振蕩培養(yǎng)后（200 rpm、2 h），加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)（37℃、150 rpm、4 h）。離心收菌，加入B平衡液重懸，冰浴超聲波破碎，離心，棄沉淀收集上清液至單個離心管保存于-20℃。取出凍存的上清液、解凍、離心（10000 rpm、30 min、4℃）。使用法瑪西亞蛋白純化儀純化0.45過濾膜過濾后的上清液（NaOH 3 ml/min，ddH2O 3 ml/min，鎳3 ml/min，ddH2O 3ml/min；B平衡液3 ml/min，上樣2 ml/min；B平衡液3 ml/min，C平衡液3 ml/min，D平衡液3 ml/min），紫外吸收（UV）檢測讀數(shù)為200左右時收集洗脫液，洗柱。收集洗脫樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 重組蛋白Tyr p 34的免疫印跡分析 將純化后的重組蛋白Tyr p 34進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。使用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，以確診為腐食酪螨過敏的患者血清作為一抗，封閉孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）清洗5次后（5 min/次），以辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgE作為二抗孵育1.5 h。再次用PBST清洗5次后（5 min/次），加入新配制的化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯色，在多功能化學(xué)發(fā)光成像儀中由顯色結(jié)果判斷重組后的Tyr p 34蛋白是否具有免疫原性。

1.2.7 Tyr p 34基因的生物信息學(xué)分析 運(yùn)用ApE軟件分析Tyr p 34基因序列，并推導(dǎo)其氨基酸序列。將該氨基酸序列與NCBI上發(fā)布的Tyr p 34氨基酸序列進(jìn)行比對，分析其同源性。運(yùn)用ProtParam預(yù)測其理化性質(zhì)、KinasePhos分析其磷酸化位點(diǎn)。使用SWISS MODEL軟件預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建Tyr p 34重組表達(dá)質(zhì)粒

構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Tyr p 34，對該質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和瓊脂糖凝膠電泳分析。在470 bp處有條帶，與理論長度基本一致，證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 Tyr p 34少量表達(dá)與蛋白鑒定

將鑒定為陽性的Tyr p 34重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，誘導(dǎo)后進(jìn)行蛋白鑒定分析。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示Tyr p 34基因成功表達(dá)。誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)量增高，在分子質(zhì)量約為20 kDa處可見明顯條帶；蛋白在高溫組中含量相對較多，上清液中可見明顯條帶，沉淀中未見明顯條帶，提示Tyr p 34蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在，見圖2。

圖2 Tyr p 34重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 Tyr p 34大量表達(dá)與純化

高溫條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)Tyr p 34蛋白，收集上清液進(jìn)行純化，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見純化后的蛋白純度較高，在分子質(zhì)量約為20 kDa處可見明顯條帶，該條帶的蛋白分子質(zhì)量與Tyr p 34蛋白的理論分子質(zhì)量基本相符，見圖3。

圖3 純化后Tyr p 34蛋白SDS-PAGE

2.4 重組蛋白Tyr p 34免疫原性鑒定

Western blot結(jié)果顯示，在理論值處可見條帶，說明重組蛋白Tyr p 34可與腐食酪螨過敏病患血清中的IgE特異性結(jié)合，表明其具有免疫原性。對照組正常人血清中不含抗腐食酪螨特異性IgE抗體，無法與重組蛋白結(jié)合，圖中未見明顯條帶。見圖4。

圖4 腐食酪螨Tyr p 34 Western blot檢測

2.5 Tyr p 34基因測序及比較分析

運(yùn)用ApE軟件分析克隆Tyr p 34基因，獲取其氨基酸序列。結(jié)果顯示該基因大小為462 bp，編碼153個氨基酸，見圖5。將該氨基酸序列與NCBI發(fā)布的Tyr p 34氨基酸序列（登錄號：ACL36923.1）進(jìn)行比對，同源性為99%，有一個氨基酸的差異，見圖6。

圖5 Tyr p 34 的cDNA序列

圖6 序列比對

2.6 Tyr p 34的理化性質(zhì)與磷酸化位點(diǎn)

使用ProtParam軟件分析腐食酪螨Tyr p 34的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C765H1200N194O266S10；相對分子質(zhì)量為17691.68 Da；總原子數(shù)為2435；理論等電點(diǎn)為4.04；氨基酸組成中谷氨酸最高，占比為15%；不穩(wěn)定系數(shù)為41.13，預(yù)測該蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)為78.43；總平均親水性為-0.516。使用KinasePhos分析其磷酸化位點(diǎn)，示Tyr p 34蛋白含有1個蘇氨酸激酶（T），為第122位氨基酸；2個絲氨酸激酶（S），為第7、62位氨基酸；2個酪氨酸激酶（Y），為第28、104位氨基酸。

2.7 Tyr p 34蛋白的三級結(jié)構(gòu)

使用SWISS MODEL軟件對序列建模，得到三維結(jié)構(gòu)圖，見圖7，表明該蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。

圖7 Tyr p 34的三級結(jié)構(gòu)

3 討論

腐食酪螨過敏原使用世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會聯(lián)合會過敏原命名小組委員會制定的系統(tǒng)過敏原命名法命名。根據(jù)該命名規(guī)范，前三個字母表示過敏原的來源，第四個字母為種名第一字母[8-9]。當(dāng)前已被命名的腐食酪螨過敏原共有10個，包括Tyr p 2、Tyr p 3、Tyr p 8、Tyr p 10、Tyr p 13、Tyr p 24（已更名為Tyr p 34）、Tyr p 28、Tyr p 35、Tyr p 36和α-Tubulin[7]。Jeong等[10]研究發(fā)現(xiàn)Tyr p 34屬于肌鈣蛋白C，是一種新的螨過敏原。該過敏原與其他螨類的氨基酸序列同源性均在64%以上，發(fā)現(xiàn)在47名塵螨過敏患者受試者中只有5名（10.6%）血清與Tyr p 34發(fā)生IgE反應(yīng)，證明Tyr p 34為次要過敏原。

研究顯示，腐食酪螨與屋塵螨和粉塵螨有共同抗原可引發(fā)人類過敏性疾病[11]。目前，臨床上治療粉螨過敏患者的有效措施是尋找過敏原，并進(jìn)行特異性免疫治療（SIT）[12]。SIT也稱為脫敏治療，通過向Ⅰ型變應(yīng)性疾病患者注射或以其他途徑給予特異性致敏的過敏原，持續(xù)并逐漸遞增藥量，使患者對過敏原適應(yīng)和耐受，并逐漸減少或消除過敏原引發(fā)的臨床癥狀[13-14]。進(jìn)行SIT時，傳統(tǒng)上采取塵螨粗浸液，但其含有其他未知的過敏原成分，可能引起患者過敏，存在提取復(fù)雜、安全性低等缺點(diǎn)。重組蛋白疫苗是通過誘導(dǎo)含有特異性抗原基因的細(xì)胞表達(dá)目的蛋白，對該重組蛋白進(jìn)行純化并進(jìn)一步修飾而制備得來的疫苗。具有純度高、產(chǎn)量高、安全穩(wěn)定的特點(diǎn)。據(jù)報道，過敏原疫苗治療已成為過敏性疾病如過敏性鼻炎治療的重要方案之一[15]。因此，研究腐食酪螨的相關(guān)過敏原成分，對其蛋白進(jìn)行純化及免疫原性鑒定，有利于腐食酪螨重組蛋白疫苗的制備。

據(jù)文獻(xiàn)報道，塵螨為誘發(fā)過敏性鼻炎、哮喘的主要過敏原[16]。別國梁等[17]對280例過敏性鼻炎患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)塵螨陽性率為75.36%，該類疾病嚴(yán)重影響了患者的正常生活及健康。此外，腐食酪螨所致的相關(guān)變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療需求也日益迫切。

本研究提取腐食酪螨Tyr p 34總RNA，通過RT-PCR得到克隆基因，并構(gòu)建重組質(zhì)粒。誘導(dǎo)該基因表達(dá)出重組蛋白并純化，進(jìn)行免疫印跡分析鑒定其免疫原性及生物信息學(xué)分析。以上信息能夠?yàn)門yr p 34重組變應(yīng)原的疫苗制備、免疫診斷和特異性免疫治療等臨床應(yīng)用研究提供理論參考。