王 飛，蔣俊春，袁 力

(1.商丘市食品藥品檢驗(yàn)中心理化一室，河南 商丘 476000；2.河南省食品藥品檢驗(yàn)所微生物室，河南 鄭州 450000)

紅參屬于名貴中藥，由人參加工制成，具有復(fù)脈固脫、大補(bǔ)元?dú)?、益氣攝血等功效[1]，主要成分為人參皂苷及強(qiáng)酸水解得到的人參二醇、人參三醇，紅參主要成分含量是判斷其質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一[2]。隨著近年來微波和超聲波在化學(xué)成分提取中的應(yīng)用越來越廣泛，極大的縮短了提取時(shí)間，提高了有效成分提取率，且操作簡便，避免了高溫對(duì)有效成分的影響[3，4]。為更好的控制紅參及其制劑的質(zhì)量，本研究建立了高效液相色譜法測定紅參中人參皂苷及人參二醇的含量，以期為其質(zhì)量控制提供理論支持。

1 儀器與試劑、試藥

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，F(xiàn)L9500色譜工作站；KQ2200E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，AUW220D型電子分析天平(日本島津公司)；超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯純水機(jī)公司)。

1.2 試劑、試藥

人參皂苷對(duì)照品Rg1(批號(hào)：110703-202034)、Rg2(批號(hào)：111779-200801)、Rb1(批號(hào)：110704-202028)、Rb2(批號(hào)：11175-201203)、Rc(批號(hào)：201865)、Rf(批號(hào)：111719-201806)、人參二醇對(duì)照品(批號(hào)110701-201715)，來源：中國食品藥品檢定研究院。紅參(產(chǎn)地河北)乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Ulitimate XB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～5min采用0～29%A洗脫，5～20min采用29%～36%A洗脫，20～22min采用36%～95%A洗脫，22～25min采用95%A洗脫。進(jìn)樣量5μL，流速0.30mL·min-1，柱溫30℃，人參皂苷檢驗(yàn)波長203nm，人參二醇檢測波長230nm[5]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取人參皂苷對(duì)照品Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf及人參二醇對(duì)照品各約10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加20%的乙腈溶液溶解后定容至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取上述溶液10mL，置100mL量瓶中，加20%的乙腈溶液定容，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，備用。

2.2.2 供試品溶液制備：取紅參樣品，粉碎，過4號(hào)篩，稱取粉末約1.5g，精密稱定，置50mL量瓶中，加50%的乙腈溶液，超聲處理40min后，放冷至室溫，加50%乙腈溶液定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定，結(jié)果供試品溶液色譜圖中主峰與對(duì)照品溶液主峰一致，分離度良好，無雜質(zhì)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.5mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL、20mL、50mL，分別置100mL量瓶中，加20%的乙腈溶液定容至刻度，搖勻，取上述不同濃度的系列溶液進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以各成分的峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y軸)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X軸)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf及人參二醇線性回歸方程。結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。見表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn): 取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，根據(jù)人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf及人參二醇峰面積的RSD判斷該方法精密度。見表2。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn): 取同一供試品溶液，分別在不同時(shí)間(0、2、4、6、8、16、24h)進(jìn)行測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積的RSD判斷供試品溶液穩(wěn)定性。見表2。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn): 精密稱取同一樣品6份，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，根據(jù)峰面積的RSD判斷該方法重復(fù)性[7]。見表2。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn): 稱取已知含量的樣品約0.75g，6份，精密稱定，分別置50mL量瓶中，分別加入混合對(duì)照品溶液5mL，制備供試品溶液進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。見表2。

表2 各成分回收率、精密度、重復(fù)性、 穩(wěn)定性測定結(jié)果

各成分的回收率、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果顯示，精密度在0.65%～1.56%，表明儀器精密度良好，穩(wěn)定性在1.40%～1.97% ，表明供試品溶液室溫條件下穩(wěn)定性良好，重復(fù)性在0.32%～2.58%，表明該方法重復(fù)性良好，各成分回收率在96.24%～102.10%，符合要求。

2.4 樣品測定結(jié)果

按照本文建立的方法，測定5批紅參樣品，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果紅參樣品中人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf平均含量分別為0.516mg/g、0.287mg/g、0.338mg/g、0.154mg/g、0.184mg/g、0.020mg/g，人參二醇平均含量為1.524mg/g。

3 討論

紅參是一種大宗藥材，除簡單加工銷售外，還可以作為原料制備成中成藥，在中成藥的加工過程中，紅參中的有效成分人參皂苷及人參二醇會(huì)受到酸堿度、溫度等影響后發(fā)生轉(zhuǎn)化，皂苷的轉(zhuǎn)化程度和種類受加工工藝的影響會(huì)有很大差別，一些皂苷類物質(zhì)可能發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成次級(jí)皂苷，但含量過低，難以檢測[8,9]。本研究采用高效液相色譜法，具有應(yīng)用廣泛、造價(jià)低等特點(diǎn)，將乙腈和水作為流動(dòng)相，分離效果好，且起到了保護(hù)色譜柱的作用，解決了磷酸鹽對(duì)色譜損耗大，清洗困難等問題，操作簡便快捷，準(zhǔn)確度高[10]。

本研究采用梯度洗脫程序，能夠同時(shí)測定多種人參皂苷及人參二醇含量，提高了效率。本研究色譜條件優(yōu)化過程中，以甲醇為空白對(duì)照，對(duì)甲醇及所有對(duì)照品進(jìn)行全波長(190～400nm)掃描，結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rf在203nm波長處有最大吸收，人參二醇在230nm波長處有最大吸收，故將該波長作為檢測波長[11]。人參皂苷與人參二醇在Ulitimate XB-C18(2)色譜柱(5μm，4.6mm×250mm)分離效果好，保留時(shí)間適中?？疾煲译?水和甲醇-水兩種梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-水作為流動(dòng)相分離度較好，經(jīng)考察流速為0.30ml/min時(shí)分離效果較理想。采用外標(biāo)法對(duì)6種人參皂苷及人參二醇含量進(jìn)行計(jì)算，為提高結(jié)果精密度，應(yīng)注意操作步驟的一致性，嚴(yán)格控制提取時(shí)間、酸堿度、溫度、水解時(shí)間等因素，在樣品吹干及轉(zhuǎn)移過程中注意產(chǎn)品丟失[12,13]。

綜上，高效液相色譜法檢測紅參中人參皂苷及人參二醇的含量效果較好，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，精密度高，且方便快捷，適用于人參皂苷及人參二醇的定量檢測。