王夕丹 周 悅 路 旭 孫良穎 王林江 尹 瑤 張月華
(貴州省六盤水市人民醫(yī)院,六盤水,553000)
酒精中毒會導(dǎo)致嚴(yán)重的急性和長期毒性,包括中樞抑制、酒精性肝病、心臟病和癡呆等[1]。相關(guān)研究表明,酒精代謝會產(chǎn)生大量的產(chǎn)物乙醛,它是引起酒精中毒的主要原因[2]。長期飲酒會損傷組織中的各種正常細(xì)胞,比較常見的癲癇、酒精中毒性腦病和酒精中毒性精神障礙等,慢性酒精中毒的作用機制比較復(fù)雜,但相關(guān)機制尚不完全清楚。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸代謝過程中的限速酶[3],它具有雙功能酶的活性,兼有COX活性和過氧化氫酶活性[4]。COX-2在多種腫瘤類型中,如肺癌、前列腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中表達(dá)升高,屬于一種致癌因子[5]。COX-2過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和凋亡等生物學(xué)關(guān)系密切[6]。葛花解酲湯全方由13味藥組成,主要有葛花、干姜、白蔻仁、砂仁、陳皮、青皮、澤瀉、茯苓、木香、豬苓、神曲、白術(shù)和人參組成,全方具有清熱解毒、疏肝利膽的功效,使酒濕得去,諸癥自解[7]。關(guān)于葛花解酲湯基于COX-2通路治療慢性酒精中毒的作用機制尚未見報道,所以本研究主要探討葛花解酲湯基于COX-2通路治療慢性酒精中毒的作用機制,為臨床慢性酒精中毒的治療提供可靠依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 動物 清潔級雄性C57BL/6J小鼠60只,體質(zhì)量18~22 g,6~8周齡,由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-003,合格證號:837236。動物倫理審批號:20190326。小鼠放于室溫為23~26 ℃,濕度為45%~60%,自然光照下培養(yǎng),并給予充足的食物和飲水,在新環(huán)境下適用7 d進行后續(xù)實驗研究。
1.1.2 藥物 葛花解酲湯藥方由葛花15 g、干姜10 g、白蔻仁10 g、砂仁10 g、陳皮10 g、青皮10 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、木香10 g、豬苓10 g、神曲10 g、白術(shù)10 g、人參10 g組成,并含生藥1.63 g/mL,均購自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)門診部。加入10倍的清水浸泡2 h,再進行煮沸1 h,濾過后,剩余的藥渣再用清水煮沸1 h,濾過后,濾液合并,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為含生藥1 g/mL的藥液,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.3 試劑和儀器 多聚甲醛、Trizol試劑(生工生物工程有限公司,貨號:BC3654.BC3722),石蠟(上海華永石蠟有限公司,貨號:SC364662),β-內(nèi)啡肽ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司,貨號:C20170629),L-半胱氨酸(Sigma公司,美國,貨號:EPR970304),醋酸鋅(北京化學(xué)試劑公司,貨號:E20190514),無水乙醇(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,貨號:A0030509),GSH試劑盒、GST試劑盒和T-AOC試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司,貨號:C402024,C502017,C502009);酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司,美國,型號:Bio-Tek ELx800),低溫離心機(ThermoFisher公司,美國,型號:SuperT21),切片機(LEICA公司,德國,型號:RM2035),離心機(北京醫(yī)用離心機廠,型號:LDZ4)。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備 將60只C57BL/6J小鼠隨機分為5組,分別為正常組、模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組,每組12只。除正常組外,其余4組分別飲用6%乙醇水溶液,連續(xù)28 d。
1.2.2 給藥方法 按照《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn),實驗小鼠用的中藥均為人體用量的10倍,建模成功的第14天后,對低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組的小鼠使用葛花解酲湯灌胃,1次/d,低劑量葛花解酲湯組每天10 mg/kg,中劑量葛花解酲湯組每天20 mg/kg,高劑量葛花解酲湯組每天40 mg/kg,正常組以10 mg/kg的生理鹽水灌胃,連續(xù)14 d。處死的前1 d禁食,正常飲水,再以6%水合氯醛腹腔注射麻醉后,取出腦組織和肝組織。
1.2.3 組織學(xué)檢查 腦組織和肝組織采用甲醛固定,脫水、石蠟包埋、切成4 μm的切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,隨機選取6個視野,觀察腦組織和肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化。
1.2.4 Western Blotting檢測COX-2蛋白的表達(dá) 每組腦組織和肝臟組織樣本50 mg,提取總蛋白,電泳處理,并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進行混合,進行裂解,加入COX-2抗體,在4 ℃的情況下孵育過夜,在加入1∶100的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,常溫下孵育2 h,在暗室中顯影,以β-肌動蛋白作為內(nèi)參,采用Quantity One軟件評估COX-2蛋白的表達(dá)水平。
1.2.5 δ阿片受體(Delta Opioid Receptor,DOR)mRNA和β-內(nèi)啡肽測定 取凍存組織放入研缽中,離心管中加入1 mL Trizol試劑,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,DOR mRNA上游5′-TGGGTTGGTTGACGC-3′,下游5′-GCAGTAGGCTATCCGT-3′,β-actin作為內(nèi)參,異物序列為上游5′-TCCAGCATACTGACAGC-3′,下游5′-GTATGGCCTACAGGAGTA-3′,PCR條件:95 ℃ 3 min,75 ℃ 30 s,55 ℃ 20 s,共計45個循環(huán)。測定β-內(nèi)啡肽使用ELISA試劑盒,取96孔板,加入腦組織勻漿上清液樣品100 μL,反應(yīng)30 min,加入酶標(biāo)工作液100 μL,反應(yīng)10 min,加入顯色溶液,反應(yīng)10 min,再加入終止反應(yīng)溶液50 μL,酶標(biāo)儀在450 nm測量各孔的OD值,按照標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制曲線,并就計算β-內(nèi)啡肽水平。
1.2.6 胱硫醚β-合酶(Cystathionine Beta-synthase,CBS)活性和H2S水平測定 取液氮凍存的小鼠腦組織制備勻漿放在25 mL錐形瓶中,加入L-半胱氨酸和5-磷酸吡哆醛,石蠟封口,90 min后,醋酸鋅和硫離子充分反應(yīng)生成硫酸鋅沉淀,加入10%三氯醋酸lmL使蛋白沉淀,棄上清液,全自動酶標(biāo)儀檢測CBS活性。分光光度法間接測定小鼠紋狀體、左右海馬、前腦皮質(zhì)中H2S水平,將磷酸鹽緩沖液倒入研磨器內(nèi),并放入腦組織,在冰上研磨,離心處理,使醋酸鋅和硫離子充分反應(yīng)生成硫酸鋅沉淀物,室溫孵育20 min,吸出上清液,用酶標(biāo)儀檢測H2S的水平。
1.2.7 乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)和乙醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)活性測定 催化乙醇的脫氫反應(yīng)生成乙醛,在取1.5 mL的pH8.8的焦磷酸鈉緩沖液與NAD+溶液和乙醇溶液混勻,室溫孵育10 min,在放入小鼠肝組織,倒入比色皿,340 nm波長下,采用分光光度計測OD值,ADH和ADLH的活力以NADH每分鐘生成量(μmo1/min)表示。
1.2.8 抗氧化指標(biāo)測定 采用化學(xué)比色法測定小鼠肝臟中谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(Glutathione S-transferase,GST)和總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)的水平,嚴(yán)格按照試劑盒的操作使用說明進行嚴(yán)格操作。
2.1 葛花解酲湯對慢性酒精中毒小鼠組織形態(tài)學(xué)的影響 小鼠海馬回C1區(qū)組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,正常組的椎體細(xì)胞層次清晰,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核清晰,排列規(guī)則;模型組椎體細(xì)胞層次不規(guī)則,細(xì)胞固縮變形,并出現(xiàn)水腫、壞死和溶解現(xiàn)象。經(jīng)過葛花解酲湯干預(yù)后,低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組的椎體細(xì)胞均有所改善,高劑量葛花解酲湯組改善最為明顯,細(xì)胞核清晰可見,排列有序,個別細(xì)胞水腫體積增大,輕度固縮,但整體接近正常。見圖1A。肝組織的病理切片顯示,正常組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整,中央靜脈周圍呈放射狀排列的肝細(xì)胞索,彼此連接成網(wǎng)狀;模型組表現(xiàn)出明顯的微血管脂肪變性和壞死;經(jīng)過低劑量、中劑量和高劑量的葛花解酲湯干預(yù)后,均出現(xiàn)了不同的改善,但高劑量葛花解酲湯組改善最為明顯,阻止了空泡的形成,微血管脂肪變性和壞死有明顯的改善。見圖1B。
圖1 各組小鼠組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,×400)
2.2 葛花解酲湯對小鼠組織中COX-2蛋白的影響 模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中COX-2蛋白水平顯著明顯高于正常組(P<0.05),低劑量葛花解酲湯組中COX-2蛋白水平顯著低于模型組(P<0.05),中劑量葛花解酲湯組中COX-2蛋白水平明顯低于低劑量葛花解酲湯組,高劑量葛花解酲湯組COX-2蛋白水平顯著低于中劑量葛花解酲湯組(P<0.05)。見表1。
表1 各組小鼠組織中COX-2蛋白水平比較
圖2 各組小鼠組織中COX-2蛋白表達(dá)
2.3 葛花解酲湯對慢性酒精中毒小鼠腦組織DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的影響 模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的水平顯著明顯高于正常組(P<0.05),低劑量葛花解酲湯組中DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的水平顯著低于模型組(P<0.05),中劑量葛花解酲湯組中DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的水平明顯低于低劑量葛花解酲湯組,高劑量葛花解酲湯組DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的水平顯著低于中劑量葛花解酲湯組(P<0.05)。見表2。
表2 各組小鼠腦組織DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽水平比較
2.4 葛花解酲湯對慢性酒精中毒小鼠腦組織CBS活性和H2S水平的影響 與正常組比較,模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中CBS活性和H2S水平明顯升高(P<0.05),低劑量葛花解酲湯組中CBS活性和H2S水平顯著低于模型組(P<0.05),中劑量葛花解酲湯組中CBS活性和H2S水平明顯低于低劑量葛花解酲湯組,高劑量葛花解酲湯組CBS活性和H2S水平顯著低于中劑量葛花解酲湯組(P<0.05)。見表3。
表3 各組小鼠CBS活性和H2S水平比較
2.5 葛花解酲湯對慢性酒精中毒小鼠肝組織ADH和ALDH活性的影響 模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組中ADH和ALDH活性較模型組相比明顯降低(P<0.05),低劑量葛花解酲湯組中的ADH和ALDH活性較模型組相比顯著升高(P<0.05),中劑量葛花解酲湯組中的ADH和ALDH活性與低劑量葛花解酲湯組相比顯著下降(P<0.05),高劑量葛花解酲湯組的ADH活性與中劑量葛花解酲湯組相比明顯降低(P<0.05),高劑量葛花解酲湯組的ALDH活性與中劑量葛花解酲湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。
表4 各組小鼠ADH和ALDH活性 比較
2.6 葛花解酲湯對慢性酒精中毒小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)的影響 與正常組比較,模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中GSH、GST和T-AOC水平顯著降低(P<0.05),低劑量葛花解酲湯組中GSH、GST和T-AOC水平明顯高于模型組(P<0.05),中劑量葛花解酲湯組中GSH、GST和T-AOC水平明顯高于低劑量葛花解酲湯組,高劑量葛花解酲湯組GSH、GST和T-AOC水平顯著高于中劑量葛花解酲湯組(P<0.05)。見表5。
表5 各組小鼠抗氧化比較
慢性酒精中毒影響著人類的健康,近年來,隨著人們生活水平的增加,慢性酒精中毒疾病的患病率逐漸增加。長期攝入酒精會導(dǎo)致小腦神經(jīng)元和大腦新皮質(zhì)、海馬、基底前腦退行改變,這些部位屬于記憶和學(xué)習(xí)活動中樞。相關(guān)研究表明,酒精可以導(dǎo)致記憶能力喪失和智能水平降低和相關(guān)的精神行為下降[8]。慢性酒精中毒主要表現(xiàn)為妄想、幻覺、震顫以及癡呆等,為了提高慢性酒精中毒的治療水平,需要建立對應(yīng)的動物模型的模擬發(fā)病機制,以尋找有效的治療藥物。研究表明,慢性酒精中毒對腦部產(chǎn)生不同程度的損害,比如脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、氧化應(yīng)激等可能是引起腦損傷的主要原因,從而致使出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)[9]。葛花解酲湯具有溫中健脾、分消酒濕,治嗜酒中虛、頭痛心煩、小便不利、大便泄瀉、眩暈嘔吐的作用[10]。相關(guān)研究也表明,葛花解酲湯具有保肝健脾的作用[11]。葛花解酲湯治療乙醇中毒的相關(guān)報道較多,但基于COX-2通路探討葛花解酲湯治療慢性酒精中毒的作用機制相關(guān)報道較少,所以本研究探討葛花解酲湯對COX-2通路的影響,并對慢性酒精中毒后與腦部和肝臟部的相關(guān)指標(biāo)進行分析。
COX-2是一種炎癥介質(zhì),COX-2通路與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)研究表明,有關(guān)炎癥或者癌癥相關(guān)的疾病主要集中在COX-2通路上,COX-2通路在許多癌癥中作為新靶向研究,包括結(jié)腸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和口腔癌等[12]。也有研究表明,COX-2在炎癥刺激的誘導(dǎo)下,水平明顯升高[13]。研究表明,COX-2的過表達(dá)在退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用[14]。本研究結(jié)果表明,模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中COX-2蛋白水平顯著明顯高于正常組,低劑量葛花解酲湯組中COX-2蛋白水平顯著低于模型組,中劑量葛花解酲湯組中COX-2蛋白水平明顯低于低劑量葛花解酲湯組,高劑量葛花解酲湯組COX-2蛋白水平顯著低于中劑量葛花解酲湯組。說明COX-2蛋白水平在慢性酒精中毒的小鼠中表達(dá)升高,經(jīng)過不同劑量的葛花解酲湯治療后,COX-2蛋白水平明顯降低。相關(guān)研究推測,慢性酒精中毒患者血清中COX-2水平可能升高,COX-2水平的升高可破壞血腦屏障[15]。
β-內(nèi)啡肽是一種內(nèi)源性阿片肽,在應(yīng)激狀態(tài)下會大量釋放。相關(guān)研究表明,酒精會促進大鼠下丘腦β-內(nèi)啡肽的釋放[16]。DOR屬于阿片肽受體,過量飲酒會致使β-內(nèi)啡肽增加和DOR基因的表達(dá)量上升。本研究結(jié)果表明,模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的水平顯著明顯高于正常組。所以說明不同劑量的葛花解酲湯可以明顯降低DOR mRNA和β-內(nèi)啡肽的水平。H2S是一種氣體信號分子,當(dāng)H2S水平達(dá)到生理水平時,可以造成不良反應(yīng),乙醇代謝產(chǎn)物乙醛的增加可以介導(dǎo)鈣離子運行,促使氧自由基的產(chǎn)生,損傷神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞。CBS能夠催化H2S生成的調(diào)節(jié)酶[17]。本研究表明,低劑量葛花解酲湯組中CBS活性和H2S水平顯著低于模型組,中劑量葛花解酲湯組中CBS活性和H2S水平明顯低于低劑量葛花解酲湯組,高劑量葛花解酲湯組CBS活性和H2S水平顯著低于中劑量葛花解酲湯組。所以說明不同劑量的葛花解酲湯可以改善CBS活性和H2S水平。模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組中ADH和ALDH活性較模型組相比明顯降低。與正常組相比,模型組、低劑量葛花解酲湯組、中劑量葛花解酲湯組和高劑量葛花解酲湯組中GSH、GST和T-AOC水平顯著降低。ADH是肝代謝酒精的主要途徑,酒精首先被ADH氧化成乙醛,乙醛在經(jīng)過ALDH被氧化成乙酸,乙酸是對人體無害的一種物質(zhì),最后被分解成二氧化碳和水[18],所以說長期飲酒會對肝臟中的ADH和ALDH的活性產(chǎn)生一定的影響,通過不同劑量葛花解酲湯治療,ADH、ALDH活性和氧化應(yīng)激指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的改善。
綜上所述,葛花解酲湯可以有效抑制COX-2通路,降低慢性酒精中毒小鼠腦組織DOR mRNA、β-內(nèi)啡肽、CBS活性和H2S水平,顯著提高慢性酒精中毒小鼠肝臟中的ADH和ALDH的活性,改善氧化應(yīng)激指標(biāo),從根本上有效地改善了慢性酒精中毒小鼠的腦和肝臟組織損傷,具有一定的治療作用。