李紅花，宋福行

（北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院 北京 100048）

交鏈孢酚（Alternariol，AOH）和交鏈孢酚單甲醚（Alternariol monomethyl ether，AME）是由鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物。鏈格孢屬廣泛分布在世界各地，可使近400 種植物致病，僅交鏈孢霉就可侵染100 多種植物[1-2]。在有利的溫度和濕度條件下，交鏈孢霉能產(chǎn)生70 多種次級代謝產(chǎn)物[3-4]。其中，最常見、研究最多的毒素是：AOH、AME、交鏈孢菌酮酸（Tenuazonicacid，TeA）、交鏈孢烯（Altenuene，ALT）、細(xì)格菌素（Altenusin，ALN）和交鏈孢毒素I、II、III（Altertoxins，ATXs）。

鏈格孢屬真菌不僅每年給農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且AOH 和AME 會對細(xì)胞和動物產(chǎn)生不良影響。動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明AOH 和AME 有致畸性和甲胎毒性；體外實(shí)驗(yàn)表明AOH和AME 有基因毒性、致裂性、致突變性、雌激素和雄激素效應(yīng)等，因而對人類和動物健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[5]。目前交鏈孢毒素的生物合成途徑已基本清楚，然而對毒素生物合成過程的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本文概述近年來AOH 和AME 的生物合成及其調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展，旨在從分子生物學(xué)的角度為毒素標(biāo)品的產(chǎn)業(yè)化提供一個新視角。

1 AOH 和AME 的生物合成

1.1 AOH 和AME 生物合成基因簇的鑒定

AOH 和AME 以及其它由鏈格孢產(chǎn)生的二苯并吡喃酮類物質(zhì)，都屬于聚酮類次級代謝產(chǎn)物。有報道顯示小麥病原菌旁星孢桿菌（Parastagonospora nodorum）產(chǎn)生AOH[6]。SnPKS19 編碼交鏈孢毒素生物合成的聚酮合成酶。通過靶向基因破壞和在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中異源表達(dá)，鑒定了在旁星孢桿菌產(chǎn)生AOH 的pks 基因。旁星孢桿菌中的SnPKS19 與交鏈孢霉中pksJ 有很高的同源性。PksJ 是Saha 等[7]在交鏈孢霉中鑒定的10種聚酮合成酶中的1 種，研究認(rèn)為PksJ 是催化AOH 和AME 生物合成的第1 步。而Wenderoth等[8]認(rèn)為這是錯誤的結(jié)論，原因可能是基于RNAi技術(shù)和表達(dá)分析下調(diào)了幾個pks 基因簇。

Wenderoth 等[9]通過CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的AOH 生物合成基因的失活和米曲霉（Aspergillus oryzae）中基因的異源表達(dá)，鑒定了AOH 和AME生物合成的基因簇（圖1）?；虼亻L度為15 kb，由聚酮合成酶I（PksI）、O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OmtI）、黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的單加氧酶（MoxI）、短鏈脫氫酶（SdrI）、推測的外二醇雙加氧酶（DoxI）和轉(zhuǎn)錄因子（AohR）組成。pksI 基因全長5 796 bp，編碼的蛋白由1 763 個氨基酸組成，估計分子質(zhì)量為192.06 ku。PksI 是一種典型的非還原型聚酮合成酶，它包含一個最小結(jié)構(gòu)域集：一個酮酰合成酶（KS），一個酰基轉(zhuǎn)移酶（AT）和一個?；d體蛋白（ACP）。在pksI 附近的4 個基因：omtI、moxI、sdrI和doxI，它們編碼的酶通常參與次級代謝產(chǎn)物的修飾。OmtI 由379 個氨基酸組成，MoxI 由385 個氨基酸組成，SdrI 由230 個氨基酸組成，DoxI 由325 個氨基酸組成。此外，該簇中還包含1 個轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，命名為aohR，該推測的轉(zhuǎn)錄因子AohR 由588 個氨基酸組成。

圖1 AOH 和AME 生物合成基因簇Fig.1 The biosynthesis gene cluster of AOH and AME

鏈格孢屬菌株中，AOH 及其衍生物的生物合成基因簇包含1 個聚酮合成酶編碼基因（pksI），4個修飾酶編碼基因：O-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因（omtI）、單加氧酶編碼基因（omtI）、短鏈脫氫酶編碼基因（sdrI）、雌二醇雙加氧酶編碼基因（doxI）和轉(zhuǎn)錄因子編碼基因（aohR）。

在米曲霉中異源表達(dá)pksI，可以實(shí)現(xiàn)AOH 的生物合成[9]。當(dāng)PksI 與不同的修飾酶在米曲霉中共表達(dá)可以得到AME、4-羥基-交替醇單甲醚（4-OH-AME）、ALN 和ALT。因此，圖1所示的生物合成基因簇負(fù)責(zé)生產(chǎn)至少5 種不同的化合物。

1.2 AOH 和AME 生物合成的研究

AOH、AME、4-OH-AME、ALN 和ALT 的生物合成途徑見圖2。由PksI 開始，將1 個乙酰輔酶A（acetyl-CoA，Ac-CoA）和6 個丙二酰輔酶A（malonyl-CoA，Mal-CoA）組裝成庚烯酮AOH。OmtI 催化9-羥基形成甲基醚，即由AOH 轉(zhuǎn)化成AME。4-OH-AME 是4 號位的羥基加成后的產(chǎn)物。內(nèi)酯環(huán)的開啟由SdrI 催化。另一種途徑從內(nèi)酯形成前的SdrI 還原步驟開始。在AME 的5 和5’位置甲基化和羥基化形成ALN。ALT 的產(chǎn)生可能從ALN開始，由DoxI 催化[9]。

圖2 交鏈孢毒素生物合成途徑Fig.2 The biosynthesis pathway of altertoxins

2 AOH 和AME 生物合成的調(diào)控機(jī)制

由于鏈格孢屬真菌缺乏有性周期，產(chǎn)生多細(xì)胞的無性孢子，克隆子代的分離很困難。因此對其進(jìn)行遺傳操作比較困難。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，絲狀真菌的基因組編輯也越來越成熟，尤其是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在多種絲狀真菌中的應(yīng)用，使得遺傳操作更簡單，這也有力地促進(jìn)了絲狀真菌中豐富的次級代謝產(chǎn)物的生物合成及其調(diào)控機(jī)制的研究[10]。在交鏈孢霉中已經(jīng)建立了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可以有效地用于基因失活[11]。Fraeyman 實(shí)驗(yàn)室選擇黑色素生物合成途徑的2 個基因pksA 和bmr2 作為靶點(diǎn)，通過原生質(zhì)體再生或孢子接種純化菌株，得到若干白色突變體。此外，將熒光蛋白融合到來自構(gòu)巢曲霉StuA 轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號中，轉(zhuǎn)化后可見亮核，證明熒光蛋白（GFP）可以應(yīng)用于交鏈孢霉中。這也為交鏈孢霉中轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了便利。到目前為止，對AOH 和AME生物合成調(diào)控機(jī)制的研究主要集中在以下5 個方面。

2.1 光照調(diào)控

許多真菌能夠使用1 種或幾種光感受器對光作出反應(yīng)[12-14]。這些真菌對光的感知會影響無性分生孢子的形成、性發(fā)育、色素沉著、生物鐘和次級代謝[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，對能感應(yīng)光照的真菌來說，藍(lán)光和紅光的影響非常重要。例如，粗糙脈孢菌對藍(lán)光信號的感知與藍(lán)光蛋白White-Collar 1（WC-1）的分子功能有關(guān)[15-16]。WC-1 與另一個藍(lán)光蛋白White-Collar 2（WC-2）形成復(fù)合物WCC，WCC 可以作為光適應(yīng)蛋白的正調(diào)節(jié)器。WCC 是光激活的，并直接與光調(diào)控基因的啟動子結(jié)合[17]。最近人們發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉中，藍(lán)光和紅光感應(yīng)色素蛋白以及一些額外的蛋白質(zhì)也可以形成一種光調(diào)節(jié)復(fù)合體[18]。

Pruss 等[19]發(fā)現(xiàn)交鏈孢霉中毒素的產(chǎn)生和孢子的形成是由光以相反的方式調(diào)控的。在光照條件下，孢子的形成明顯減少，而AOH 的產(chǎn)量則可提高2～3 倍。ATX 的生產(chǎn)甚至嚴(yán)格依賴于光。所有觀察到的光效應(yīng)都可以由藍(lán)光觸發(fā)，而紅光只有很小的影響。光照對孢子形成的抑制作用在黑暗培養(yǎng)1 d 后是可逆的。在交鏈孢霉基因組中發(fā)現(xiàn)了與編碼脈粗孢孢菌WC-1 相關(guān)的同源基因，命名為lreA。由于lreA 基因缺失，無論有無光照均抑制了孢子的形成。在藍(lán)光照射下，lreA 突變體在黑暗條件下強(qiáng)烈誘導(dǎo)了ATX 的形成。此外，將交鏈孢霉在mCDB 瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃持續(xù)暗光、白光、藍(lán)光和紅光條件下培養(yǎng)7 d，AME 和ATX-I 只在白光和藍(lán)光條件下可檢測到。AOH 在白光和藍(lán)光下產(chǎn)量增加。這些研究表明，交鏈孢霉能夠感知和響應(yīng)光線，光照對AOH 的形成具有激活功能，并將LreA 作為主要光受體。

Igbalajobi 等[20]進(jìn)一步研究了光感受器FphA和LreA 的作用以及與高滲透壓甘油（HOG）絲裂原活化蛋白（MAP）激酶途徑的相互作用。研究表明，在交鏈孢霉中，藍(lán)、紅2 種光感受器的作用明顯且相互重疊。對許多模式生物的研究揭示了光調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。光感受器控制著交鏈孢霉的形態(tài)發(fā)生途徑、活性氧的穩(wěn)態(tài)和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。另一方面，高滲透壓傳感需要FphA 和LreA，這表明在光和壓力信號之間存在復(fù)雜的交叉調(diào)控過程。

2.2 溫度調(diào)控

AOH 和AME 的生物合成受溫度影響，然而沒有過多的文獻(xiàn)介紹溫度對毒素生物合成的影響。Pruss 等[19]對交鏈孢霉發(fā)酵過程中的溫度進(jìn)行檢測，將交鏈孢霉在mCDB 瓊脂培養(yǎng)基上，不同溫度下黑暗培養(yǎng)7 d，試驗(yàn)表明AOH 和AME 在22，25，28 ℃時產(chǎn)量相同，然而在30 ℃時兩者產(chǎn)量都大幅下降[19]。

2.3 pH 調(diào)控

在搖瓶培養(yǎng)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下，生長培養(yǎng)基的pH 值對交鏈孢霉AOH 和AME 的產(chǎn)量有影響[21]。pH 值在4.0～4.5 時，AOH 和AME 的產(chǎn)生最適宜。pH 值在4.0 時，檢測到最高的AOH 質(zhì)量濃度，達(dá)到5.7 mg/L，與pH 值為5.5 相比，提高了63%。pH 值在4.5 時，AME 質(zhì)量濃度也達(dá)到最高，而產(chǎn)量僅為1.73 mg/L。當(dāng)pH 值高于5.5 時，交鏈孢毒素的產(chǎn)量顯著降低。pH 值是6.5 時，AOH 產(chǎn)量降低到0.73 mg/L，pH 值是7.5 時，僅能檢測到AOH，產(chǎn)量僅0.61 mg/L，pH 值是8.0 時，完全抑制交鏈孢毒素的產(chǎn)生。即當(dāng)pH 值高于5.5時，AOH 和AME 的產(chǎn)生會減少或完全抑制。

2.4 碳源、氮源調(diào)控

碳源、氮源作為重要的營養(yǎng)因子可以調(diào)控真菌中毒素的合成。赭曲霉毒素[22-23]、黃曲霉毒素[24]和交鏈孢毒素[25]等真菌毒素的生物合成依賴于碳、氮源。研究表明不同種類的碳、氮源對不同真菌毒素生物合成的影響不同[26]。對幾種培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，霉菌毒素的產(chǎn)生在所有測試的復(fù)合或不確定的培養(yǎng)基（如大米）中，明顯高于測試的確定成分的培養(yǎng)基，如Czapek-Dox 培養(yǎng)基和Vogel’s培養(yǎng)基[27]。然而，為了闡明碳源或氮源的影響，需要一種更明確的培養(yǎng)基，以便培養(yǎng)基成分可以交換，并盡可能排除含有不明確的培養(yǎng)基成分的組合效應(yīng)。半合成改良的Czapek-Dox 培養(yǎng)基中交鏈孢霉生長狀態(tài)良好，且霉菌毒素產(chǎn)量較高，AOH產(chǎn)量達(dá)3.5～3.6 mg/L，AME 產(chǎn)量達(dá)1.4～1.5 mg/L。于是Brzonkalik[28]實(shí)驗(yàn)室就使用改良后的Czapek-Dox 半合成培養(yǎng)基，補(bǔ)充碳、氮源，檢測不同碳、氮源對毒素合成的影響。此外，還考察了振蕩和靜態(tài)培養(yǎng)對AOH 和AME 合成的影響。最初的試驗(yàn)結(jié)果表明氮源的消耗和霉菌毒素的產(chǎn)生之間有明顯的相關(guān)性。試驗(yàn)測試了各種氮源，包括幾種銨鹽、硝酸鹽和氨基酸。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，使用單一的銨鹽或硝酸鹽似乎都能抑制毒素的產(chǎn)生。苯丙氨酸能顯著提高AOH 和AME 的產(chǎn)量。搖瓶培養(yǎng)中AOH 和AME 的總產(chǎn)量低于靜態(tài)培養(yǎng)。不同氮源的AOH 和AME 產(chǎn)量對不同發(fā)酵方式（搖培與靜培）的響應(yīng)不同。添加硝酸銨和天冬氨酸，在振動培養(yǎng)基中，AOH 和AME 的產(chǎn)量與靜態(tài)培養(yǎng)基幾乎相同，而添加苯丙氨酸，產(chǎn)量卻大大降低。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，在氯化銨和硝酸鈉組合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，交鏈孢毒素水平升高，然而仍低于生物反應(yīng)器控制的發(fā)酵。使用硝酸銨或天冬氨酸可使產(chǎn)量提高3 倍左右。

此外，對多種碳源進(jìn)行測試，包括單糖、雙糖、淀粉等復(fù)合糖以及甘油和乙酸。在搖培中，葡萄糖、果糖、蔗糖、乙酸或葡萄糖/蔗糖和葡萄糖/乙酸的混合物作為碳源產(chǎn)生AOH 和AME。Brzonkalik等[28]進(jìn)一步利用不同碳、氮源的組合進(jìn)行發(fā)酵，檢測AOH 和AME 產(chǎn)量的變化情況。結(jié)果顯示銨態(tài)氮和硝態(tài)氮替換天冬氨酸，AOH 最大質(zhì)量濃度提高了2.2 倍，達(dá)到7.75 mg/L，AME 產(chǎn)量提高到4.81 mg/L。葡萄糖與乙酸替換銨和硝酸鹽的結(jié)合抑制了AME 的形成，僅檢出AOH，其最大質(zhì)量濃度提高1.9 倍，達(dá)到6.64 mg/L。與葡萄糖和銨/硝酸銨組合相比，乙酸和天冬氨酸組合沒有進(jìn)一步提高AOH 的質(zhì)量濃度，也沒有檢測到AME。

Brzonkalik 等[25，28]系統(tǒng)研究了碳、氮源對AOH和AME 生物合成的影響。綜合所有數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為霉菌毒素的產(chǎn)生不僅受碳、氮源等營養(yǎng)因素的調(diào)節(jié)，也受培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)。

2.5 分子調(diào)控

LaeA 和VeA 屬于Velvet 家族的調(diào)節(jié)蛋白。Velvet 家族的調(diào)節(jié)蛋白屬于全局性調(diào)控因子，參與許多真菌的多種功能，包括次級代謝[29-31]。在交鏈孢霉中LaeA 和VeA 參與交鏈孢霉的生長形態(tài)、無性發(fā)育和霉菌毒素的生產(chǎn)[32]。缺失laeA 和veA 基因，會顯著降低交鏈孢毒素的產(chǎn)生。veA 基因的缺失對2 株菌株的霉菌毒素產(chǎn)生均有明顯的抑制作用，而laeA 基因的缺失使1 株菌株的霉菌毒素產(chǎn)生量增加，而另1 株菌株的霉菌毒素產(chǎn)生量減少。鏈格孢屬內(nèi)的遺傳變異可能是導(dǎo)致這些差異的原因。綜上所述，交鏈孢霉Velvet 家族復(fù)合體對AOH 和AME 生物合成調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

王劉慶和王蒙[26]克隆了交鏈孢霉中氮源調(diào)控基因AaAreA。AreA 不僅能夠調(diào)節(jié)真菌氮代謝利用，而且能夠參與次生代謝、生長產(chǎn)孢、侵染致病等生命過程，包括真菌毒素的合成。敲除AaAreA后，AOH 產(chǎn)量明顯降低，表明AaAreA 通過調(diào)控氮源利用，影響AOH 的生物合成。對AaAreA 蛋白功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其響應(yīng)不同的氮源信號，AaAreA 可能直接作用于AOH 生物合成基因簇內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子AaAohR，即AaAreA 可能與AaAohR啟動子區(qū)的核苷酸序列特異性結(jié)合，激活A(yù)aAohR轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而AaAohR 蛋白調(diào)控AOH 合成酶，最終調(diào)控AOH 的生物合成。

厚樸酚是在中草藥中提取的具有抗真菌活性的物質(zhì)，對厚樸酚處理和未處理的交鏈孢霉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)厚樸酚通過下調(diào)全局性調(diào)控因子CreA 和NmrA，進(jìn)而影響pksI 和omtI 基因的表達(dá)，抑制AOH 和AME 的生物合成[33]。

aohR 是交鏈孢毒素生物合成的簇內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，aohR 的缺失導(dǎo)致pksI 表達(dá)減少，AOH 產(chǎn)生延遲，而aohR 過表達(dá)導(dǎo)致pksI 表達(dá)增加，AOH 產(chǎn)量增加。即簇內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子aohR 參與AOH 生物合成的調(diào)控[8]。

3 展望

本文總結(jié)了光照、pH 值、溫度、碳源、氮源和全局性調(diào)控因子對AOH 和AME 生物合成的調(diào)控。這可能有助于提供更多有關(guān)真菌毒素產(chǎn)生的生理和代謝途徑的信息，并為提高AOH 和AME的產(chǎn)量提供參考。隨著人們對真菌聚酮合酶的基因工程和外源表達(dá)，以及合理生產(chǎn)新化合物的途徑越來越感興趣[34]。了解這些化合物生物合成的分子遺傳基礎(chǔ)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵。許多真菌聚酮類化合物的合成與它們的pks 基因有關(guān)[35]。

由于鏈格孢霉毒素在食品和水源中頻繁出現(xiàn)，對人和動物健康可能產(chǎn)生有害影響[36]。2011年，歐洲食品安全局（EFSA）應(yīng)歐盟的請求，審查食品和飼料中鏈格孢毒素的安全性[37]。我國尚未制定相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)，鑒于其毒性、污染范圍及對人體的潛在危害，將鏈格孢毒素確定為“新興霉菌毒素”[38]。成為可能引起關(guān)注的化合物，中國與世界各國未來應(yīng)加快速度建立鏈格孢毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，從而更好地為食品安全保駕護(hù)航。

此外，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以及交鏈孢霉中遺傳操作系統(tǒng)的逐漸成熟，為從全局水平研究AOH 和AME 生物合成的調(diào)控機(jī)制提供了條件，為全面改造交鏈孢霉奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。