牛廣財，張 琪，朱 丹，顏飛翔，魏文毅，寧志雪，王思溥

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江大慶 163319 2 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心 黑龍江大慶 163319 3 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 黑龍江大慶 163319）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），為胡頹子科沙棘屬，果實呈類球形或圓球形，為藥食同源植物[1]。沙棘果實中富含維生素C、多種微量元素、有機(jī)酸、黃酮、胡蘿卜素、氨基酸等營養(yǎng)成分[2-6]，對心腦血管、腫瘤等疾病都有良好的治療效果，且具有抗菌、抗氧化，降低心腦血管疾病和美容等功效[7-11]。

食用植物酵素是植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有某些特定生物活性成分的可食用酵素產(chǎn)品[12-13]。該產(chǎn)品一般具有消炎殺菌，加速新陳代謝，調(diào)理腸道功能以及修容抗老等效果[14-15]。當(dāng)前，我國酵素的發(fā)酵方式仍依靠較為傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，這種發(fā)酵方式存在發(fā)酵持久，易受環(huán)境影響等多種弊端，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵液中微生物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，最終難以保證酵素類產(chǎn)品的質(zhì)量。一些學(xué)者也研究了酵素中的微生物，然而，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法得到的微生物十分有限，且耗時耗力。近年來，高通量測序技術(shù)在微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究方面，有明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢[16-17]，可以快捷地得到樣品中復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)，是分析復(fù)雜多菌種樣品的首選方法[18-19]。例如，陳寵等[20]通過高通量測序技術(shù)分析海棠酵素發(fā)酵過程中微生物的變化規(guī)律，結(jié)果表明，發(fā)酵0～31 d 時真菌主要為酵母屬（Saccharomyces）和假絲酵母屬（Candida）。康曉樂等[21]在研究蘋果自然發(fā)酵酵素微生物多樣性時得出：在屬水平上，真菌主要有酵母屬、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）和接合酵母屬（Zygosacharomyces），其中，前期、中期和后期的接合酵母屬 （89.5%，18.2%，80.3%） 和漢遜酵母屬（9.7%，60.6%，8.7%）為真菌中的優(yōu)勢菌屬。姚笛等[22]在研究火龍果、藍(lán)莓、桑葚3 種酵素中真菌的群落結(jié)構(gòu)中得出：3 種酵素的優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota），而在優(yōu)勢真菌屬方面，奧默柯達(dá)酵母屬（Kodamaea）在火龍果和桑葚酵素中占據(jù)主要地位，帚枝霉屬（Sarocladium）與漢遜酵母屬是藍(lán)莓酵素的優(yōu)勢真菌屬。

截止目前，尚未見自然發(fā)酵過程中沙棘酵素真菌群落等方面的研究。本試驗通過高通量測序技術(shù)分析沙棘酵素自然發(fā)酵過程中真菌rRNA 基因ITS1 區(qū)，揭示沙棘酵素發(fā)酵過程中真菌群落的演替規(guī)律，以期開發(fā)出沙棘酵素的優(yōu)良菌種，為后期的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

深秋紅大果沙棘，黑龍江省孫吳縣，在-18 ℃冷凍保存。

DNA 抽提試劑盒（FastDNA?Spin Kit for Soil），美國MP Biomedicals 公司；Axygen Biosciences AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，美國Axygen 公司；biowest agArose 瓊脂糖，西班牙biowest 公司；FastPfu Polymerase DNA 聚合酶，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；MiSeq Reagent Kit v3 測序試劑盒，美國Illumina 公司。

1.2 設(shè)備與儀器

QMZ-PBJ-11 多功能榨汁機(jī)，德國科瑪斯（KORMES） 公司；GHP-9160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DW-86L158 超低溫冰箱，杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；Eppendorf 5424R 高速臺式冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司；QuantusTMFluorometer 微型熒光計，美國普洛麥格公司；ELx800 酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700 型PCR 儀，美國ABI 公司；Illumina Miseq 測序儀，美國Illumina 因美納公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 前期處理：將自然緩凍后的冷凍大果沙棘，用打漿機(jī)打漿，加入2.0 mL/kg 的Pectinex BEXXL 果膠酶，在45 ℃下酶解4 h[23]；然后調(diào)糖至21°Brix[3]，于22 ℃恒溫發(fā)酵。

樣品采集：分3 個階段進(jìn)行樣品采集，前期（F22_Q）：發(fā)酵72 h；中期（F22_Z）：發(fā)酵624 h；后期（F22_H）：發(fā)酵1 584 h。將樣品混合均勻后，取15 mL 置于離心管中，在-80 ℃下保存待測[13]。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 適量樣品在冰上融化，4℃，12 000 r/min 離心10 min 后取樣，電泳條件：2%瓊脂糖膠，電壓5 V/cm，時間20 min。

1.3.3 DNA 抽提和PCR 擴(kuò)增 總DNA 抽提依照說明書的步驟進(jìn)行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測定DNA 濃度和純度[24]；使用ITS1 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，選用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3’）和ITS2R （5’-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3’）對16S rRNA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，30 個循環(huán)，然后72℃穩(wěn)定延伸10 min[25]，最后在4 ℃保存[26]。PCR 反應(yīng)體系為：5×Fast Pfu Buffer 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物 （5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個樣本3個重復(fù)[27]。

1.3.4 Illumina Miseq 測序 利用Miseq PE300平臺測序，此過程送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行操作。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger 生信云平臺 （https：//www.isanger.com）對高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分別使用Trimmomatic 軟件原始測序序列和FLASH 軟件進(jìn)行質(zhì)控和拼接；繼續(xù)使用UPARSE 軟件，采用97%的相似度對序列進(jìn)行OTU 聚類并剔除嵌合體[28]。然后用RDP classifier 對每條序列進(jìn)行物種分類注釋[29]，設(shè)置比對閾值為70%[30]，進(jìn)行Unite的真菌數(shù)據(jù)庫比對。采用隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們對應(yīng)的多樣性指數(shù)，構(gòu)建Rarefaction curve，選擇97%相似度的屬水平，利用mothur 計算不同隨機(jī)抽樣下的α-多樣性指數(shù)，然后用R 語言工具作圖[31]；采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗評估物種豐度差異的顯著性水平 （P＜0.05）；采用Circos-0.67-7 軟件制作Circos 圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂凝膠電泳鑒定

由沙棘酵素發(fā)酵液中真菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖（圖1）可知，3 個發(fā)酵階段共采集了9 個樣本，其PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小正確，特異性和亮度等也都符合要求。

圖1 PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoresis

2.2 測序樣本數(shù)據(jù)分析

對9 個樣品進(jìn)行高通量測序，序列擴(kuò)增區(qū)域為ITS1F_ITS2R，進(jìn)而得到原始序列信息，插入線片段長度為300，測序長度為PE300，原始序列數(shù)目為1691062×2，總堿基數(shù)為1 018 019 324。進(jìn)一步得到優(yōu)化序列信息如表1所示，有效序列數(shù)目為1 691 062，有效堿基數(shù)目為433 941 642，序列平均長度為256 bp。即沙棘酵素樣本優(yōu)化序列區(qū)間為56 927～70 448 條，平均長度區(qū)間為236.85～258.95 bp。

表1 測序樣本信息Table 1 Sequencing sample information

2.3 測序深度分析

用Sobs 和Shannon 指數(shù)稀釋曲線來反映不同發(fā)酵時期沙棘酵素在不同測序數(shù)量時的真菌多樣性。如圖2和圖3所示，由sobs 指數(shù)可知，在小于40 000 時，多樣性指數(shù)增加較快，之后開始趨于平緩。說明測序的數(shù)據(jù)量是合理的[13]，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種[32]。當(dāng)其多樣性指數(shù)為Shannon 時，曲線已經(jīng)趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量已夠大[33]，說明能夠真實反應(yīng)此發(fā)酵液中所包含真菌的信息[34]。

圖2 Sobs 指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of Sobs index

圖3 Shannon 指數(shù)稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of Shannon index

2.4 α-多樣性分析

根據(jù)樣本中的α-多樣性分析結(jié)果，能夠得知沙棘酵素發(fā)酵液中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度。根據(jù)表2數(shù)據(jù)可知，沙棘酵素不同發(fā)酵時期每組的Coverage 值均在99.99%以上，說明該測序深度完全能夠覆蓋該酵素發(fā)酵過程中真菌的種類，能夠真實反映發(fā)酵液中真菌種類的多樣性及豐度[35]。由Shannon 指數(shù)可以看出群落分布的多樣性情況，該指數(shù)越大，表明發(fā)酵液中真菌的多樣性越高[36]，Simpson 指數(shù)與Shannon 指數(shù)的作用一致，均可估算群落多樣性的高低，不同的是利用Simpson 指數(shù)估算發(fā)酵液中微生物的多樣性時，指數(shù)越大，則微生物群落的多樣性越低[37]?？v觀整個發(fā)酵進(jìn)程，Shannon 指數(shù)逐漸下降，這與張琪等[13]的結(jié)果一致。Simpson 指數(shù)逐漸升高，說明隨著發(fā)酵時間的延長，沙棘酵素真菌群落的多樣性在逐漸降低。Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)反映的是群落的豐富度，根據(jù)表2中數(shù)據(jù)可以明顯看出2 個指數(shù)均呈現(xiàn)減少的趨勢，說明，群落的豐富度逐漸減少。其原因可能是隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中酸含量增加，導(dǎo)致不耐酸的真菌逐漸消失，因此真菌群落的豐富度和多樣性有所減少，也可能是發(fā)酵液中糖類等營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，導(dǎo)致部分真菌死亡，從而使得群落的豐富度和多樣性下降。

表2 α-多樣性指數(shù)表Table 2 Table of α-diversity indexess

由圖4可知，9 個樣本中共有182 個OTU，其中F22_Q、F22_Z、F22_H 分別含有OTU 的數(shù)量為87，48，47，其中特有的OTU 數(shù)分別為35，6，5。根據(jù)OTU 統(tǒng)計得到1 個界，4 個門，16 個綱，35 個目，71 個科，98 個屬，112 個種。由此可見，隨著沙棘酵素的自然發(fā)酵，OTU 數(shù)呈下降趨勢，說明發(fā)酵前期真菌群落結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，而后期真菌菌群的多樣性在逐漸降低。即沙棘酵素在自然發(fā)酵的整個過程中真菌群落變化較大，該結(jié)果與之前α-多樣性指數(shù)分析情況相同。

圖4 不同發(fā)酵階段中真菌OTU 韋恩圖Fig.4 Venn diagram of fungus OTU during different fermentation stages

2.5 樣品間門水平真菌群落組成分析

圖5所示為門水平上沙棘酵素發(fā)酵液中真菌群落結(jié)構(gòu)分布情況，將豐度較小的門除掉后，樣本中主要含有子囊菌門、毛霉菌門（Mucoromycota）以及擔(dān)子菌門（Basidiomycota）這3 個門，與韓國強(qiáng)等[35]研究復(fù)配小曲白酒發(fā)酵過程中真菌菌門的類型一致。其中，子囊菌門為發(fā)酵前期和中期的絕對優(yōu)勢菌門，相對豐度比例為76.97%～96.30%，毛霉菌門在發(fā)酵過程中相對豐度為2.39%～77.50%，是發(fā)酵后期的絕對優(yōu)勢菌門；擔(dān)子菌門的相對豐度為1.30%～23.01%，是發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌門。該發(fā)酵過程中毛霉菌門的相對豐度逐漸升高，而擔(dān)子菌門呈逐漸降低的趨勢。

圖5 門水平上群落豐度比例Fig.5 The ratio of community abundance of phylum level

2.6 樣品間真菌群落屬水平組成分析

表3為沙棘酵素自然發(fā)酵中發(fā)酵液中真菌在屬水平上的變化情況。發(fā)酵前期刺盤孢屬（Colletotrichum） 為絕對優(yōu)勢菌屬，所占比例為30.64%，然而在整個發(fā)酵過程中，該菌屬豐度逐漸減少，中期所占比例為0.81%，至后期減少至0.69%；之后各真菌屬及比例依次為：紅酵母屬（Rhodotorula）22.84%，Hymenopleella 19.30%，鏈格孢屬（Alternaria）6.84%，附球菌屬（Epicoccum）5.18%，擬莖點霉屬（Phomopsis）4.20%，未分類的亞隔孢殼科真菌（unclassified_f_Didymellaceae）4.08%，迷迭菌屬 （Didymella）2.42%，葡萄孢屬（Botrytis）1.06%，鐮孢霉屬（Fusarium）0.61%，青霉屬 （Penicillium）0.24%和曲霉屬（Aspergillus）0.04%；發(fā)酵中期未分類的酵母目（unclassified_o_Saccharomycetales）為絕對優(yōu)勢菌屬，所占比例為58.06%，之后的優(yōu)勢菌屬及比例分別為：黃絲曲霉屬（Talaromyces）21.85%、威克漢姆酵母菌屬（Wickerhamomyces）5.70%；發(fā)酵后期毛霉屬（Mucor）成為絕對優(yōu)勢菌屬，所占比例為77.50%，之后依次為：鐮孢霉屬7.91%和威克漢姆酵母菌屬6.25%。綜合來看，在沙棘酵素發(fā)酵過程中，毛霉屬逐漸增加，刺盤孢屬和紅酵母屬則逐漸下降。

表3 沙棘酵素樣本中真菌在屬水平上的種類構(gòu)成Table 3 The composition of fungi at genus level in sea buckthorn Jiaosu samples

2.7 真菌群落熱圖分析

由圖6沙棘酵素真菌群落結(jié)構(gòu)熱圖可知，該酵素整個發(fā)酵過程能夠聚為兩類，在發(fā)酵前期（F22_Q）一類，發(fā)酵中期（F22_Z）與后期（F22_H）一類?？傌S度排在前15 位的真菌菌屬可聚為3類，即刺盤孢屬、紅酵母屬、Hymenopleella、迷迭菌屬、擬莖點霉屬、鏈格孢屬、附球菌屬、未分類的亞隔孢殼科真菌聚為一類，發(fā)酵前期豐度較高，發(fā)酵中后期豐度下降；毛霉屬單獨聚為一類，隨著發(fā)酵時間的延長，真菌群落相對豐度呈先升高后下降的趨勢，以中期相對豐度最高；未分類的酵母目與黃絲曲霉屬，威克漢姆酵母菌屬與鐮孢霉屬，青霉屬與曲霉屬聚為一類，菌屬豐度趨勢均是中后期逐漸升高。

圖6 真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.6 Fungi community structure heatmap of genus level

2.8 沙棘酵素不同發(fā)酵階段真菌群落差異分析

采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗評估物種豐度差異的顯著性水平，獲得樣本間顯著性差異物種。如圖7所示，在屬水平上對3 組不同發(fā)酵階段的沙棘酵素進(jìn)行優(yōu)勢屬的組間差異性檢驗分析，顯示毛霉屬、未分類的酵母目和紅酵母屬這3 個菌屬，在3 組樣本之間有顯著差異（P<0.05）。

圖7 沙棘酵素自然發(fā)酵過程中真菌差異性檢驗圖Fig.7 Diversity test chart during sea buckthorn Jiaosu natural fermentation

2.9 真菌群落組成種水平Circos 圖分析

Circos 樣本與物種關(guān)系圖，一方面可以看出優(yōu)勢物種組成比例[38]，另一方面也反映各優(yōu)勢物種在不同樣本（分組）中的分布比例[39]。由圖8可知，在種水平上，未分類的刺盤孢菌（unclassified_g_Colletotrichum）為發(fā)酵前期絕對優(yōu)勢菌種，所占比例為31%，其它前期占比較高的有膠紅酵母（Rhodotorula_mucilaginosa） 和Hymenopleella_sp，所占比例分別為23%和19%；發(fā)酵中期未分類的酵母目和未分類的裸節(jié)菌的占比最高，分別為58%和22%；然而在發(fā)酵后期，真菌卷枝毛霉所占比例最高，達(dá)到75%，已經(jīng)占據(jù)主導(dǎo)地位，而發(fā)酵前期的絕對優(yōu)勢菌種未分類的刺盤孢菌在中期和后期則迅速減少，到后期時已降至6.9%。由此可見，該自然發(fā)酵條件下沙棘酵素真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性及動態(tài)變化的復(fù)雜性。

圖8 真菌群落組成種水平Circos 圖Fig.8 The Circos map of fungi community structure of species level

3 討論

沙棘酵素在自然發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性較為復(fù)雜，在發(fā)酵前期、中期和后期獨有OTU 數(shù)分別為35，6 和5，說明隨著發(fā)酵時間的延長，一些微生物之間競爭激烈，在酵素體系中適應(yīng)能力相對較弱的真菌會被淘汰[40]，沙棘酵素真菌菌群的豐富度和多樣性逐漸降低。在發(fā)酵前期，刺盤孢屬為絕對優(yōu)勢菌屬，所占比例為30.64%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，該菌屬呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，占比降至中期的0.81%和后期的0.69%；發(fā)酵中期未分類的酵母屬為絕對優(yōu)勢菌屬，所占比例為58.06%；而在發(fā)酵后期，毛霉屬則為絕對優(yōu)勢菌屬，所占比例為77.50%。高慶超等[40]在研究黑果枸杞酵素自然發(fā)酵過程中真菌群落的動態(tài)演替中得到32 種已知真菌屬，在發(fā)酵0，10，20，30 d 時，絕對優(yōu)勢真菌屬均為鏈格孢屬，所占比例分別為25.52%，18.84%，38.97%，17.60%，在發(fā)酵40 d 和50 d 時絕對優(yōu)勢真菌為鎖瑚菌屬（Membranomyces），所占比例分別為34.42%，23.59%，在發(fā)酵60 d 時，絕對優(yōu)勢真菌為酵母屬，所占比例為89.83%，發(fā)酵60 d 后，主要真菌屬為酵母屬中的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。這說明沙棘酵素和黑果枸杞酵素在自然發(fā)酵的中后期，酵母菌和霉菌起主要作用，這與Okada 等[41]研究結(jié)果一致。然而，與邸鵬月等[42]和陰芳冉[43]的結(jié)果不同，邸鵬月等[42]分析桑葚酵素發(fā)酵中微生物多樣性時發(fā)現(xiàn)，桑葚酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期的優(yōu)勢真菌屬是酵母（92.16%），隨著發(fā)酵時間的延長，酵母逐漸減少甚至消亡；陰芳冉[43]采用高通量測序技術(shù)研究紅樹莓自然發(fā)酵過程中微生物的群落演替得出，樹莓發(fā)酵液CD 中真菌的優(yōu)勢菌屬酵母屬的豐富度由發(fā)酵30 d 的65.74%，降低至發(fā)酵120 d的29.39%；同時，哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）的豐富度由發(fā)酵30 d 的19.72%，逐漸升高至120 d 的44.91%，逐步替代釀酒酵母屬轉(zhuǎn)變?yōu)闃漭l(fā)酵液中的優(yōu)勢菌，漢遜酵母屬的豐富度也由發(fā)酵30d 時的14.35%，升高至發(fā)酵120d 的25.47%。說明紅樹莓酵素自然發(fā)酵中后期，其真菌菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，由釀酒酵母屬向哈薩克斯坦酵母屬和漢遜酵母屬演替。上述研究結(jié)果說明，在酵素發(fā)酵過程中真菌動態(tài)變化是非常復(fù)雜的，許多真菌可能受發(fā)酵環(huán)境中滲透壓、酸度或者乙醇等物質(zhì)的影響，以及不同微生物間的相互作用而發(fā)生不同的動態(tài)演替變化。因此，深入挖掘不同酵素發(fā)酵過程中的微生物變化規(guī)律，進(jìn)而探究其與營養(yǎng)成分結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，將是今后重點研究的方向。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)，對于自然發(fā)酵的沙棘酵素中真菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行了分析。根據(jù)OTUs 得到4 個門，16 個綱，35 個目，71個科，98 個屬，112 個種。真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度在前期（F22_Q）最高，之后真菌群落的物種豐富度和多樣性均呈下降趨勢；發(fā)酵前、中期的絕對優(yōu)勢菌門均為子囊菌門，相對豐度為76.97%～96.30%，毛霉菌門是發(fā)酵后期的絕對優(yōu)勢菌門，相對豐度為2.39%～77.50%；在屬水平上，刺盤孢屬為發(fā)酵前期絕對優(yōu)勢菌屬，相對豐度為30.64%，發(fā)酵中期絕對優(yōu)勢菌屬為未分類的酵母目，相對豐度為58.06%，毛霉屬為發(fā)酵后期絕對優(yōu)勢菌屬，相對豐度為77.50%；整個發(fā)酵階段可聚為F22_Q 一類和F22_Z 與F22_H 一類，樣本在毛霉屬、未分類的酵母目、紅酵母屬3 種菌屬之間具有顯著性差異（P<0.05）；在種水平上，發(fā)酵前期絕對優(yōu)勢菌種為未分類的刺盤孢菌 （所占比例31%），發(fā)酵中期未分類的酵母目和未分類的裸節(jié)菌的占比最高，分別為58%和22%，發(fā)酵后期真菌卷枝毛霉所占比例最高，達(dá)到75%。本試驗研究了自然發(fā)酵過程中沙棘酵素真菌多樣性及其結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，從而為今后沙棘酵素的開發(fā)提供理論依據(jù)，以期生產(chǎn)出更高質(zhì)量的沙棘酵素產(chǎn)品。