王澤玉，張曉霞，吳 勇，王 欣，李金杰，戴雪玲，尚小雅

（北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100191）

小薊[Cirsium setosum （Willd.） MB.]為菊科薊屬植物刺兒菜的干燥地上部分，為多年生草本植物，廣泛分布于我國大部分地區(qū)；其嫩葉是民間喜歡食用的一種野菜，具有豐富的營養(yǎng)和藥用價(jià)值[1]。文獻(xiàn)報(bào)道小薊具有止血、凝血、抗菌、抗炎、抑制腫瘤，以及降脂、降糖、提高心肌收縮力、升壓、抗疲勞和抗衰老等作用[2]。小薊止血、凝血等的活性因子已研究清楚，而對于小薊中抗腫瘤活性因子除本課題組的研究外，未檢索到其它文獻(xiàn)報(bào)道。由于小薊可食用、安全無毒，常作為藥飲與其它藥物聯(lián)用，治療膀胱癌、肺癌等，提取物在體外MTT實(shí)驗(yàn)中對人源化的肝癌、胃癌和宮頸癌等細(xì)胞均具較好的抑制作用[3-4]。以小薊為對象，研究其抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，建立質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，開發(fā)能夠長期食用且預(yù)防或緩解腫瘤的功能食品，具有重要的實(shí)際意義。

本課題組一直致力于小薊抗腫瘤活性因子的挖掘。在體外MTT 活性指導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)小薊提取物的主要樣品量和抗腫瘤活性集中在乙醇提取石油醚萃取部位。借助正相硅膠色譜分離純化方法，將石油醚萃取部位分成11 個(gè)不同極性的組分，發(fā)現(xiàn)其中5 個(gè)組分顯示出較好的體外抑制多種人腫瘤細(xì)胞的活性，課題組前期從上述活性組分中分離鑒定了26 個(gè)化合物，其中8 個(gè)化合物具有細(xì)胞毒活性[3-7]。本文繼續(xù)對石油醚部位剩余未研究的強(qiáng)活性亞組分進(jìn)行分析，以徹底明確其抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)；為小薊抗腫瘤的應(yīng)用、預(yù)防或緩解腫瘤功能食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小薊采自安徽九華山，經(jīng)九華山黃精研究所柯云武工程師鑒定為菊科植物小薊（Cirsium setosum （Willd.） MB），標(biāo)本（20081028）保存于北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

GF254薄層色譜（TLC）硅膠和160～200 目柱色譜硅膠，青島海洋化工廠；Sephadex LH-20 凝膠，GE 公司；低壓反相硅膠色譜柱和正相氰基色譜柱，ISCO 公司；高壓液相C18 Sunfire 和X-bridge制備柱（250 mm×10 mm×5 μm），Waters 公司；甲醇、乙醇、丙酮、氯仿和石油醚等均為分析純級，北京化學(xué)試劑廠；HPLC 色譜級和UPLC 質(zhì)譜級甲醇、乙腈，美國Fisher 公司；試驗(yàn)用超純水，美國Millipore 制水機(jī)制備；四甲基偶氮唑鹽（MTT），德國Serva 公司；1640 培養(yǎng)液，用時(shí)臨時(shí)配制。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi 公司；CombiFlash 低壓快速色譜分離儀，美國ISCO 公司；2545 HPLC色譜儀、2998 型檢測器，美國Waters 公司；Thermo QE Plus orbitrap 高分辨質(zhì)譜儀，美國賽默飛公司；Inova 500 核磁共振儀，美國Varian 公司；Millipore 超純水儀，美國密理博公司。

1.3 單體的制備方法

小薊干燥地上部分20 kg，依次用體積分?jǐn)?shù)95%，80%和60%的乙醇超聲（380 W）提取3 次、每次1 h，合并提取液減壓濃縮得浸膏；浸膏水溶后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到石油醚（468.5 g）、乙酸乙酯（180.0 g）和水相3 部分。體外細(xì)胞毒活性測試發(fā)現(xiàn)石油醚部位對多種人源性腫瘤細(xì)胞有較好的抑制活性，用石油醚部分過正相硅膠柱色譜，流動性用石油醚-丙酮 （100∶1～0∶100）分成極性不同的11 個(gè)組分：Sh1～Sh11；體外MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組分Sh2，Sh4，Sh5，Sh7，Sh9 均顯示出較好的細(xì)胞毒活性，課題組前期已從上述活性組分分離鑒定了26 個(gè)化合物，其中8 個(gè)化合物具有細(xì)胞毒活性[4，6-7]，本文繼續(xù)對Sh9 中的亞組分進(jìn)行研究。

組分Sh9 經(jīng)正相硅膠柱層析，流動相用石油醚-丙酮[（100∶1）～（2∶1）]梯度洗脫，得到亞組分Sh9-1～Sh9-7。將亞組分Sh9-2 經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 柱色譜，石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）反復(fù)洗脫，再經(jīng)Wates 2545 高效液相Sunfire制備柱制備，流動性甲醇-水（95∶5），流速為18 mL/min 洗脫，得到化合物1（6 mg，tR=17 min，紫外檢測波長238 nm）。亞組分Sh9-7 經(jīng)低壓快速分離儀C18 反相flash 柱色譜，流動相甲醇-水[（65∶35）～（100∶0）]梯度洗脫，純化后的樣品過凝膠柱，流動相為石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）洗脫，主要餾分加熱溶于丙酮，放置冷卻后析出白色沉淀，將其反復(fù)沉淀過濾，得到化合物2（15 mg）。亞組分Sh9-6 經(jīng)快速分離儀氰基flash 柱色譜，流動相石油醚-丙酮[（50∶1）～（2∶1）]梯度洗脫，得到的主成分在丙酮中放置出現(xiàn)沉淀，沉淀經(jīng)低壓快速分離儀C18 反相flash 柱色譜，流動相甲醇-水[（60∶40）～（100∶0）]梯度洗脫，純化后的樣品上Waters 2545 高效液相X-bridge 制備柱制備，流動性甲醇-水（93∶7），流速為18 mL/min 洗脫，得到化合物3（5 mg，tR=21.0 min，紫外檢測波長238 nm）、化合物4（8 mg，tR=19.5 min，紫外檢測波長238 nm）和化合物5（6 mg，tR=19.0 min，紫外檢測波長238 nm）。

1.4 化合物的質(zhì)譜分析

將分離得到的單體化合物用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，過0.22 μm 濾膜后直接進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析。高分辨質(zhì)譜條件參數(shù)：離子源：HESI；掃描模式：正離子模式和負(fù)離子模式；噴霧電壓：正離子（3.5 kV），負(fù)離子（4.0 kV）；鞘氣流量：50 units；輔助氣流量10 units；離子源溫度：320 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃；分辨率：70 000；二級碰撞能量：20，40，60 eV 歸一化能量；一級質(zhì)譜掃描范圍：m/z：100～500。

1.5 細(xì)胞毒活性篩選方法

收集生長良好的5 種腫瘤細(xì)胞（HCT-116：人結(jié)腸癌細(xì)胞，HepG2：人肝癌細(xì)胞，BGC-823：人胃癌細(xì)胞，NCI-H1650：人肺支氣管癌細(xì)胞，A2780：人卵巢癌細(xì)胞），用含10%牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基配制成1×104cell/mL 細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL（含1 000 個(gè)腫瘤細(xì)胞），置于37 ℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h 后加樣。試驗(yàn)設(shè)空白對照和樣品組，受試樣品設(shè)低、中、高3個(gè)濃度（1，10，100 μg/mL），每個(gè)濃度3 個(gè)平行孔，置于37 ℃，5%CO2溫箱里培養(yǎng)4 d。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 溶液（0.4 mg/mL，RPMI 1640 配制）100 μL，37 ℃孵育4 h。棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，輕度振蕩溶解Fomazan 顆粒，置于酶標(biāo)儀上，在540 nm 檢測波長下測定OD 值，計(jì)算其抑制率。以藥物的不同濃度及對細(xì)胞的抑制率作圖，可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度 （IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 3 β-羥基豆甾-5-烯-7-酮的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物為白色粉末。1H-NMR 譜中高場區(qū)顯示6 個(gè)甲基質(zhì)子信號，其中有2 個(gè)單峰質(zhì)子信號δH1.20（3H，s） 和0.68 （3H，s），3 個(gè)雙峰質(zhì)子信號δH0.93 （3H，d，J=6.5 Hz）、0.83 （3H，d，J=7.0 Hz）和0.81 （3H，d，J=7.0 Hz） 和1 個(gè)三重峰質(zhì)子信號δH0.85 （3H，t，J=8.0 Hz）；低場區(qū)顯示1 個(gè)雙鍵質(zhì)子信號δH5.69（1H，s），較低場有1 個(gè)明顯的多重峰連氧質(zhì)子信號δH3.68 （1H，m），提示結(jié)構(gòu)是含不飽和鍵的甾體化合物。13C-NMR 譜顯示該結(jié)構(gòu)有29 個(gè)碳原子，低場信號δC202.4，165.2，126.3，結(jié)合氫譜低場信號δH5.69，提示結(jié)構(gòu)中含有α，β-不飽和酮的結(jié)構(gòu)片段，雙鍵上有1 個(gè)叔碳、1 個(gè)季碳；連氧碳信號δC70.7，結(jié)合氫譜較低場中多重峰質(zhì)子信號δH3.68 （1H，m），推測結(jié)構(gòu)是3 位羥基的豆甾烯酮類結(jié)構(gòu)。HRESIMS 一級質(zhì)譜顯示m/z：429.37234 [M+H]+（理論計(jì)算值：429.37271），分子式為C29H48O2；二級特征碎片離子 有411.36194，393.35144，369.31519，271.20541，229.15872，213.16377，197.13251，175.11182；根據(jù)碎片離子推測此結(jié)構(gòu)是3β-羥基豆甾-5-烯-7-酮（3β-Hydroxystigmast-5-en-7-one）；將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]比對發(fā)現(xiàn)，二者數(shù)據(jù)一致，故確證了所推導(dǎo)結(jié)構(gòu)的正確性。

圖1 3β-羥基豆甾-5-烯-7-酮的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compounds 3β-hydroxystigmast-5-en-7-one

2.1.2 豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物為針狀結(jié)晶（丙酮）。1H-NMR 譜顯示6 個(gè)甲基質(zhì)子信號，其中有2 個(gè)甲基單峰質(zhì)子信號δH1.66 （3H，s） 和0.77 （3H，s），3 個(gè)甲基質(zhì)子雙峰信號δH1.10 （3H，d，J=6.5 Hz），0.83 （3H，d，J=6.0 Hz），0.80（3H，d，J=7.5 Hz） 和1 個(gè)甲基質(zhì)子三重峰信號δH0.86 （3H，t，J=6.5 Hz）；2 個(gè)與氧相連的質(zhì)子信號δH2.94 （1H，m） 和4.85 （1H，m），2 個(gè)雙鍵質(zhì)子信號δH5.21 （1H，dd，J=15.0，8.5 Hz） 和5.06 （1H，dd，J=15.0，9.0 Hz）。13CNMR 譜顯示29 個(gè)碳原子，低場有2 個(gè)雙鍵碳信號δc138.9 和129.4，3 個(gè)連氧的碳信號δc76.3，75.9，67.3。根據(jù)氫和碳譜的特征數(shù)據(jù)推斷，此結(jié)構(gòu)為含有1 個(gè)雙鍵和3 個(gè)羥基的豆甾醇類化合物。HRESIMS 一級質(zhì)譜顯示m/z：445.36871 [M+H]+（理論計(jì)算值：445.36872），分子式為C29H50O3；二級特征碎片離子有 427.26258，409.34802，407.33206，353.28513；根據(jù)碎片離子推測此結(jié)構(gòu)是豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇（Stigmast-22-ene-3β，5α，6β-triol）；將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]和[10]比對發(fā)現(xiàn)，二者數(shù)據(jù)一致，故確證了所推導(dǎo)結(jié)構(gòu)的正確性。

圖2 3β-羥基豆甾-5-烯-7-酮的核磁圖Fig.2 NMR of compound 3β-hydroxystigmast-5-en-7-one

圖3 3β-羥基豆甾-5-烯-7-酮的質(zhì)譜圖Fig.3 MS of 3β-hydroxystigmast-5-en-7-one

圖4 豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structure of stigmast-22-ene-3β，5α，6β-triol

圖5 5α-豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇的核磁圖Fig.5 NMR of 5α-stigmast-22-ene-3β，5α，6β-triol

圖6 5α-豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇的質(zhì)譜圖Fig.6 MS of 5α-stigmast-22-ene-3β，5α，6β-triol

2.1.3 6 β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物為白色粉末。1H-NMR 譜高場區(qū)顯示6 個(gè)甲基質(zhì)子信號，其中有2 個(gè)單峰質(zhì)子信號δH1.55（3H，s） 和0.73 （3H，s），3 個(gè)雙峰質(zhì)子信號δH1.01 （3H，d，J=6.5 Hz）、0.91 （3H，d，J=8.0 Hz）和0.87 （3H，d，J=7.0 Hz），1 個(gè)三重峰質(zhì)子信號δH0.90 （3H，t，J=7.5 Hz）；低場區(qū)2 個(gè)質(zhì)子信號[連氧質(zhì)子信號δH4.55 （1H，br s） 和烯鍵質(zhì)子信號δH6.05 （1H，s）]，提示結(jié)構(gòu)為含α，β-不飽和酮的甾體。13C-NMR 譜29 個(gè)碳原子，碳譜低場信號δC199.6，125.8，169.8，結(jié)合氫譜相應(yīng)低場信號δH6.05 （1H，s），確證結(jié)構(gòu)存在α，β-不飽和酮片段；1 個(gè)連氧碳信號δC72.5，結(jié)合氫譜質(zhì)子信號δH4.55 （1H，br s），表明結(jié)構(gòu)有1 個(gè)羥基；推測結(jié)構(gòu)中存在羥基、α，β-不飽和酮的甾體結(jié)構(gòu)。HRESIMS 一級質(zhì)譜顯示m/z：429.37234 [M+H]+（理論計(jì)算值：429.37271），分子式為C29H48O2；二級特征碎片離子有411.36197，393.35156，175.11182，159.11691；根據(jù)碎片離子推測此結(jié)構(gòu)是6β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮 （6β-Hydroxy-stigmasta-4-en-3-one）；將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]比對發(fā)現(xiàn)，二者數(shù)據(jù)一致，故確證了所推導(dǎo)結(jié)構(gòu)的正確性。

圖7 6β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮的結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structure of 6β-hydroxy-stigmasta-4-en-3-one

圖8 6β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮的核磁圖Fig.8 NMR of 6β-hydroxy-stigmasta-4-en-3-one

圖9 6β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮的質(zhì)譜圖Fig.9 MS of 6β-hydroxy-stigmasta-4-en-3-one

2.1.4 6 β-羥基-豆甾-4，22-二烯-3-酮的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物為白色粉末。1H-NMR 和13C-NMR 譜與化合物3 十分相似，仔細(xì)對照波譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，母核數(shù)據(jù)完全一致，差別只是支鏈22 位飽和鍵變成了雙鍵。HRESIMS 一級質(zhì)譜顯示m/z：427.35654[M+H]+（理論計(jì)算值：427.35706），分子式為C29H46O2，也表明結(jié)構(gòu)中少了2 個(gè)氫原子；二級特征碎片離子有409.34613，365.61716，271.20587，253.19574，123.08091；根據(jù)碎片離子推測此結(jié)構(gòu)是6β-羥基-豆甾-4，22-二烯-3-酮（6β-Hydroxystigmasta-4，22-dien-3-one）；將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]比對發(fā)現(xiàn)，二者數(shù)據(jù)一致，故確證了所推導(dǎo)結(jié)構(gòu)的正確性。

2.1.5 6 β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物為無色針狀結(jié)晶 （丙酮）。1H-NMR 和13C-NMR 譜與化合物3 十分相似，仔細(xì)對照發(fā)現(xiàn)，13C-NMR 譜只有28 個(gè)碳原子，比化合物3 少了1個(gè)碳；母核數(shù)據(jù)與化合物3 完全相符，差別在支鏈；化合物3 中23 位碳的位置在δC26.4，而此結(jié)構(gòu)中向底場移動了4.2 ppm 到δC30.6，24 位碳從δC46.0 向高場移動了7 ppm 到δC39.0，25 位碳從δC29.5 向低場移動了3.1 ppm 到δC32.6；推測24 位連接的乙基變成了甲級。HRESIMS 一級質(zhì)譜顯示m/z：415.35641 [M+H]+（理論計(jì)算值：415.35696），分子式為C28H46O2；二級特征碎片離子有397.34647，379.33597，343.29968，271.20575，229.15891，217.15872，217.15872，175.11186，159.11694；根據(jù)碎片離子推測此結(jié)構(gòu)是6β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮 （6β-Hydroxycampest-4-en-3-one）；將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]和[12]比對發(fā)現(xiàn)，二者數(shù)據(jù)一致，故確證了所推導(dǎo)結(jié)構(gòu)的正確性。

圖10 6β-羥基-豆甾-4，22-二烯-3-酮的結(jié)構(gòu)式Fig.10 Structure of 6β-hydroxy-stigmasta-4，22-dien-3-one

圖11 6β-羥基-豆甾-4，22-二烯-3-酮的核磁圖Fig.11 NMR of 6β-hydroxy-stigmasta-4，22-dien-3-one

圖12 6β-羥基-豆甾-4，22-二烯-3-酮的質(zhì)譜圖Fig.12 MS of 6β-hydroxy-stigmasta-4，22-dien-3-one

圖13 6β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮的結(jié)構(gòu)式Fig.13 Structure of 6β-hydroxycampest-4-en-3-one

圖14 6β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮的核磁圖Fig.14 NMR of 6β-hydroxycampest-4-en-3-one

2.2 化合物的核磁波譜數(shù)據(jù)

2.2.1 3 β-羥基豆甾-5-烯-7-酮的波譜數(shù)據(jù) 化合物為白色粉末。HRESIMS m/z：429.37234[M+H]+（理論計(jì)算值：429.37271）。1H-NMR （CDCl3，500 MHz）δH：5.69 （1H，s，H-6），3.68 （1H，m，H-3），1.20 （3H，s，H-19），0.93 （3H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.85 （3H，t，J=8.0 Hz，H-29），0.83（3H，d，J=7.0 Hz，H-26），0.81 （3H，d，J=7.0 Hz，H-27），0.68 （3H，s，H-18）；13C-NMR （CDCl3，125 MHz） δC：36.5 （C-1），31.4 （C-2），70.7（C-3），42.0 （C-4），165.2 （C-5），126.3 （C-6），202.4 （C-7），45.6 （C-8），50.1 （C-9），38.9 （C-10），21.4 （C-11），38.4 （C-12），43.3 （C-13），50.1 （C-14），26.5 （C-15），28.7 （C-16），54.9（C-17），12.1 （C-18），17.5 （C-19），36.2 （C-20），19.1 （C-21），34.1 （C-22），26.3 （C-23），46.0 （C-24），29.3 （C-25），19.9 （C-26），19.2（C-27），23.2（C-28），12.1（C-29）。

圖15 6β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮的質(zhì)譜圖Fig.15 MS of 6β-hydroxycampest-4-en-3-one

2.2.2 豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇的波譜數(shù)據(jù) 化合物為針狀結(jié)晶（丙酮）。HRESIMS 一級質(zhì)譜顯示m/z：445.36871 [M+H]+（理論計(jì)算值：445.36872），分子式為C29H50O3。1H-NMR （C5D5N，500 MHz）δH：5.21 （1H，dd，J=15.0，8.5 Hz，H-22），5.06（1H，dd，J=15.0，9.0 Hz，H-23），4.85 （1H，m，H-5），2.94 （1H，m，H-6），1.66 （3H，s，CH3-19），1.10 （3H，d，J=6.5 Hz，CH3-21），0.86（3H，t，J=6.5 Hz，CH3-29），0.83 （3H，d，J=6.0 Hz，CH3-27），0.77 （3H，s，CH3-18），0.80（3H，d，J=7.5 Hz，CH3-26）；13C-NMR （C5D5N，125 MHz） δ：32.5 （C-1），33.3 （C-2），67.3 （C-3），42.8 （C-4），75.9 （C-5 or C-6），76.3 （C-6 or C-5），35.7（C-7），31.2（C-8），45.9 （C-9），39.2（C-10），21.5 （C-11），40.8 （C-12），42.9 （C-13），56.4 （C-14），24.7 （C-15），29.4 （C-16），56.7 （C-17），12.5 （C-18），17.2 （C-19），40.5（C-20），19.2 （C-21），138.9 （C-22），129.4 （C-23），51.4 （C-24），32.1 （C-25），21.7 （C-26），21.2（C-27），25.6（C-28），12.5（C-29）。

2.2.3 6 β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮的波譜數(shù)據(jù) 化合物為白色粉末。HRESIMS m/z：429.37234[M+H]+（理論計(jì)算值：429.37271），分子式為C29H48O2。1H-NMR （C5D5N，500 MHz） δ：6.05（1H，s，H-4），4.55 （1H，br s，H-6），1.55 （3H，s，H-19），1.01 （3H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.91（3H，d，J=8.0 Hz，H-27），0.90 （3H，t，J=7.5 Hz，H-29），0.87 （3H，d，J=7.0 Hz，H-26），0.73（3H，s，H-18）；13C-NMR （C5D5N，125 MHz） δ：37.4 （C-1），34.7 （C-2），199.6 （C-3），125.8 （C-4），169.8 （C-5），72.5 （C-6），39.9 （C-7），30.3（C-8），54.1 （C-9），38.4 （C-10），21.3 （C-11），39.7 （C-12），42.7 （C-13），56.1 （C-14），24.4（C-15），28.5 （C-16），56.3 （C-17），12.1 （C-18），19.5 （C-19），36.4 （C-20），18.9 （C-21），34.2 （C-22），26.4 （C-23），46.0 （C-24），29.5（C-25），20.0 （C-26），19.2 （C-27），23.4 （C-28），12.1（C-29）。

2.2.4 6 β-羥基-豆甾-4，22-二烯-3-酮的波普數(shù)據(jù) 化合物為白色粉末。HRESIMS m/z：427.35654 [M+H]+（理論計(jì)算值：427.35706），分子式為C29H46O2。1H-NMR （C5D5N，500 MHz） δ：6.05 （1H，s，H-4），5.23 （1H，d，J=15，9 Hz，H-22），5.08 （1H，d，J=15，9 Hz，H-23），4.54（1H，br s，H-6），1.55 （3H，s，H-19），1.10 （3H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.89 （3H，t，J=7.5 Hz，H-29），0.92 （3H，d，J=6.5 Hz，H-27），0.87 （3H，d，J=7.0 Hz，H-27），0.75 （3H，s，H-18）；13CNMR （C5D5N，125 MHz）δ：37.4 （C-1），34.7 （C-2），199.5 （C-3），125.8 （C-4），169.8 （C-5），72.5 （C-6），39.8 （C-7），30.5 （C-8），54.1 （C-9），38.4 （C-10），21.3 （C-11），39.7 （C-12），42.5 （C-13），56.1 （C-14），24.5 （C-15），29.3（C-16），56.2 （C-17），12.2 （C-18），19.5 （C-19），40.8 （C-20），21.4 （C-21），138.7 （C-22），129.5 （C-23），51.4 （C-24），32.1 （C-25），21.2（C-26），19.2 （C-27），25.7 （C-28），12.5 （C-29）。

2.2.5 6 β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮的波普數(shù)據(jù) 化合物為無色針狀結(jié)晶 （丙酮）。HRESIMS m/z：415.35641 [M+H]+（理論計(jì)算值：415.35696），分子式為C28H46O2。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：6.05（1H，s，H-4），4.55 （1H，br s，H-6），1.55 （3H，s，H-19），0.99 （3H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.89（3H，d，J=7.0 Hz，H-27），0.84 （3H，d，J=6.5 Hz，H-26），0.83 （3H，d，J=7.5 Hz，H-28），0.72（3H，s，H-18）；13C-NMR （C5D5N，125 MHz） δ：37.4 （C-1），34.7 （C-2），199.6 （C-3），125.8 （C-4），169.8 （C-5），72.5 （C-6），39.9 （C-7），30.3（C-8），54.1 （C-9），38.4 （C-10），21.3 （C-11），39.7 （C-12），42.7 （C-13），56.1 （C-14），24.4（C-15），28.5 （C-16），56.3 （C-17），12.1 （C-18），19.5 （C-19），36.1 （C-20），18.8 （C-21），33.9 （C-22），30.6 （C-23），39.0 （C-24），32.6（C-25），20.3 （C-26），18.3 （C-27），15.5 （C-28）。

2.3 細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

采用MTT 法對分離得到的5 個(gè)單體化合物分別進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性驗(yàn)證，結(jié)果如表1所示。

表1 細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果Table 1 Cytotoxic data of compounds

3 結(jié)論

在體外MTT 活性測試指導(dǎo)下，從小薊石油醚未研究的亞組分中，借助常壓、低壓和高壓液相色譜，并利用正相硅膠、氰基硅膠、C18 反向硅膠以及Sephadex LH-20 凝膠填料，分離得到5 個(gè)化合物；并對分離得到的化合物借助一維核磁和高分辨質(zhì)譜確定了化合物的結(jié)構(gòu)，再與已知文獻(xiàn)比對，確證了結(jié)構(gòu)的正確性。采用MTT 法對分離得到的5 個(gè)單體化合物分別進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性驗(yàn)證，除化合物豆甾-22-烯-3β，5α，6β-三醇以外，其它4 個(gè)化合物對HCT-116 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞均有明顯抑制作用；其中6β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮對HCT-116 細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，而6β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮對HepG2 細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，推測羰基可能是其活性基團(tuán)。此外，3β-羥基豆甾-5-烯-7-酮、6β-羥基-豆甾-4-烯-3-酮和6β-羥基-蕓苔甾-4-烯-3-酮對HGC-823 細(xì)胞具有抑制作用，僅3β-羥基豆甾-5-烯-7-酮對NCI-H1650 細(xì)胞有抑制作用。所有被測化合物對A2780 細(xì)胞均無抑制作用。