劉文穎，張江濤，王 憬，畢 園，馮曉文，谷瑞增，侯俊財

（1 中國農(nóng)業(yè)大學工學院 北京 100083 2 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心 北京 100015 3 東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 哈爾濱 150030）

我國大米產(chǎn)量豐富，其產(chǎn)量和消費量位居全球第一位。大米蛋白可以從大米淀粉生產(chǎn)中獲得，也可從米糠和碎米中直接提取[1]。大米蛋白氨基酸組成平衡合理，含有8 種人體必需氨基酸，近似“完全蛋白”，生物價高達77%，與牛肉和蝦仁等相似[2]，營養(yǎng)價值非常高。此外，與其它谷物蛋白質(zhì)相比，大米蛋白還具有低過敏性，不含抗營養(yǎng)因子，消化率高，無色素干擾及味道柔和等特點[1-2]。近年來，動、植物源生物活性肽的制備、活性鑒定與機理研究已成為食品科學研究領域的一個熱點。采用溫和的酶法水解大米蛋白，可以提高大米蛋白的附加值，實現(xiàn)對大米蛋白的精深加工與利用，并有效改善其功能屬性，更易消化吸收[3-4]。

大米低聚肽是大米蛋白經(jīng)酶解、分離、濃縮、干燥等工藝得到的小分子肽類物質(zhì)。大米低聚肽具有極其豐富的生物活性，且食用安全性高，具有抗氧化，抗高血壓，降膽固醇，預防慢性疾病，緩解疲勞，美容養(yǎng)顏以及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[2]。無論是在醫(yī)療健康方面，還是在食品和化妝品方面，抗氧化活性都發(fā)揮著重要作用，對于機體而言，蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子的氧化損傷會造成機體紊亂，從而引發(fā)多種疾病[5]。對于食品來說，抗氧化劑可以減緩食品氧化腐敗，延長食品的貨架期。對于化妝品來說，抗氧化劑可以防止自由基對皮膚造成的氧化損傷，減緩皮膚衰老。大米低聚肽作為一種天然、安全的抗氧化物質(zhì)具有良好的應用潛力。大米低聚肽的溶解性好，在較寬的pH 值范圍能完全溶于水，并且無渾濁現(xiàn)象和沉淀物產(chǎn)生，是研制功能性飲料的理想原料之一。然而，在生產(chǎn)、儲存和應用過程中，肽類物質(zhì)存在因脫酰胺、氧化、水解或環(huán)化等作用而引起的降解風險，可能會造成多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其抗氧化活性也可能降低或喪失[6]。目前對這方面的研究鮮有報道。有必要考察加工處理過程中溫度和pH 值對大米低聚肽抗氧化活性的影響，以及大米低聚肽在人體胃腸道環(huán)境下抗氧化活性的變化，這對其在功能性飲料中的應用有重要參考價值。

本文以大米蛋白粉為原料制備大米低聚肽，在對其掃描電鏡、理化性質(zhì)以及肽段序列分析的基礎上，以分子質(zhì)量分布、二級結(jié)構(gòu)和氧自由基吸收能力（ORAC）為指標，研究不同溫度、pH 值和消化方式對大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響，為研發(fā)具有抗氧化活性的大米低聚肽功能性飲料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米蛋白粉，北京中食海氏生物技術有限公司；堿性蛋白酶（≥400 000 DU/g）、中性蛋白酶（≥1 600 AU/g），杜邦丹尼斯克公司；胃蛋白酶（≥250 units/mg）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、Fluorescein（熒光指示劑）、分子量標準品、Trolox（水溶性維生素E）均為色譜純級，美國Sigma 公司；胰蛋白酶（≥250 NFU/mg），美國Solarbio 公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜純級，美國Fisher 公司。

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，普瑞斯機械有限公司；FE20K 型pH 計，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E 超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；Phenom Prox 臺式掃描電子顯微鏡，F(xiàn)EI 公司；J-810 圓二色譜儀，美國Jasco 公司；LC-20A 高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；Spectra MR 多功能酶標儀，美國Dynex 公司；SpectraMax i3x 多功能酶標儀，美國MD 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大米低聚肽的制備 稱取500 g 大米蛋白粉，溶解于蒸餾水中，置于50 ℃水浴鍋中，用NaOH 溶液（0.1 mol/L）將pH 值調(diào)節(jié)至8.5，然后進行堿性蛋白酶酶解處理2 h，加酶量以2 500 units/g 原料為參考，再用鹽酸（0.1 mol/L）將水解液pH 值調(diào)節(jié)為6.0，繼續(xù)用中性蛋白酶酶解，加酶量以3 000 units/g 原料為參考，酶解時間為2 h。整個過程用0.1 mol/L 的HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)水解液pH值，使pH 值保持不變。酶解完成將水解液于沸水浴中進行滅酶10 min，然后冷卻至室溫離心，離心力為6 000×g，離心時間為10 min，離心完成取上清液，用孔徑為200 nm 的陶瓷膜過濾，再將過濾清液用截留分子質(zhì)量為1 000 u 的超濾膜超濾，將濾過液濃縮并冷凍干燥，得到大米低聚肽粉[7]。

1.2.2 熱穩(wěn)定性測定 稱取1.2 g 大米低聚肽，用去離子水將大米低聚肽配制為6 管20 mL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的大米低聚肽水溶液，將其分別放置在室溫（25 ℃）以及30，40，60，80，100 ℃水浴條件下水浴2 h 之后，冷卻至室溫，再分別進行分子質(zhì)量分布、圓二色光譜和ORAC 值測定[8]。

1.2.3 酸、堿穩(wěn)定性測定 取6 支50 mL 離心管，分別稱取0.1 g 大米低聚肽于離心管中，溶解于蒸餾水中，用鹽酸（1 mol/L）和NaOH 溶液（1 mol/L）將5 管大米低聚肽溶液的pH 值依次調(diào)為2，4，6，8，10，另外1 管保持初始pH 值，作為對照，然后各管分別定容到10 mL，使其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，然后在37 ℃水浴條件下水浴2 h，再進行分子質(zhì)量分布、圓二色光譜和ORAC 值測定[8]。

1.2.4 體外模擬消化穩(wěn)定性測定

1.2.4.1 胃蛋白酶消化 分別稱取5 g 大米低聚肽和0.2 g NaCl，溶解于蒸餾水中，用濃度為1 mol/L 的鹽酸將pH 值調(diào)節(jié)為2.0，在37 ℃水浴條件下水浴片刻，再加入0.05 g 胃蛋白酶，消化1 h，消化完成后將溶液放置在100 ℃沸水浴中滅酶10 min，調(diào)節(jié)pH 值為7.5，定容到20 mL，質(zhì)量濃度為10 mg/mL。胃蛋白酶消化處理完成后，在對其進行分子質(zhì)量分布、圓二色光譜和ORAC 值測定[8-9]。

1.2.4.2 胰蛋白酶消化 分別稱取5 g 大米低聚肽和0.68 g KH2PO4，溶解于蒸餾水中，用濃度為1 mol/L 的NaOH 溶液將pH 值調(diào)節(jié)為7.5，在37 ℃水浴條件下水浴片刻，然后立即用0.05 g 胰蛋白酶消化4 h，消化完成后將溶液放置在沸水浴中滅酶10 min，定容到20 mL，質(zhì)量濃度為10 mg/mL。胰蛋白酶消化處理完成后，再進行分子質(zhì)量分布、圓二色光譜和ORAC 值測定[8-9]。

1.2.4.3 胃蛋白酶消化后再胰蛋白酶消化 按照1.2.4.1 的方法進行胃蛋白酶消化、加熱滅酶活后，用濃度為1 mol/L 的NaOH 溶液將pH 值調(diào)節(jié)為7.5，在37 ℃水浴條件下水浴片刻，然后立即用0.05 g 胰蛋白酶消化4 h，消化完成后將溶液放置在沸水浴中滅酶10 min，定容到20 mL，質(zhì)量濃度為10 mg/mL。同時，以不加入消化酶的樣品作為對照。胃蛋白酶消化后再用胰蛋白酶消化處理，再對其進行分子質(zhì)量分布、圓二色光譜和ORAC 值測定[8-9]。

1.2.5 分子質(zhì)量分布測定 使用反相高效液相凝膠色譜法進行分子質(zhì)量分布測定。流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸為45∶55∶0.1 （體積比）；色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流速：0.5 mL/min；樣品質(zhì)量濃度：1.0 mg/mL；進樣體積：10 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃。將樣品溶液用孔徑0.2 μm 的聚四氟乙烯濾膜過濾，然后上機進行凝膠過濾。相對分子質(zhì)量標準曲線的繪制是利用乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、桿菌酶和細胞色素C 配制成0.001 g/mL 的溶液[10]。

1.2.6 圓二色光譜掃描 利用圓二色光譜儀測量樣品（質(zhì)量濃度0.25 mg/mL）的圓二色光譜，對于波長分析，設置的參數(shù)為步長0.2 nm，帶寬2.0 nm，光譜范圍185～260 nm，掃描速度200 nm/min。原始數(shù)據(jù)處理是將樣品的光譜減去緩沖液的基線光譜，再使用Jasco 軟件將得到的數(shù)值轉(zhuǎn)換為摩爾橢圓率（θ）[11]。

1.2.7 ORAC 值的測定 將25 μL 樣品溶液和100 μL 的0.8 μmol/L 熒光指示劑Fluorescein 混合于96 孔板中，然后加入75 μL 偶氮類化合物AAPH（150 mmol/L），此為試驗組。然后用25 μL各種濃度梯度的Trolox 標準品（6.25，12.5，25，50，100，250，500 μmol/L）繪制標準曲線，用25 μL 磷酸緩沖液（pH=7.4，75 mmol/L）作為空白對照，在37 ℃下孵育20 min，最后用熒光酶標儀測定，其激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm，總測定時間為150 min，每隔2 min 測定1 次。同時以磷酸緩沖液代替AAPH 作為對照。以樣品和標準品的熒光衰退曲線的保護面積之比計算樣品的ORAC值，最終結(jié)果用μmol/g Trolox 表示[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗平行測定3 次，試驗結(jié)果用“平均值±標準差”表示，采用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，用Duncan0.05進行平均數(shù)之間顯著性差異分析，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著，并使用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響

2.1.1 分子質(zhì)量分布 大米低聚肽分別在室溫（25 ℃） 以及30，40，60，80，100 ℃條件下水浴2 h后，其分子質(zhì)量分布如表1所示。可以看出，大米低聚肽主要是分子質(zhì)量較小的肽段，其小于1 000 u 分子質(zhì)量的組分高達90%以上。相關研究指出分子質(zhì)量大小直接關系著肽的抗氧化性強弱，分子質(zhì)量較小的肽抗氧化活性較強，并且此類肽段的氨基酸殘基數(shù)目一般在20 個以內(nèi)[13]。因此，從分子質(zhì)量來看，大米低聚肽是具有抗氧化活性潛力的物質(zhì)。在不同溫度下水浴2 h 后，各個分子質(zhì)量范圍的大米低聚肽比例變化很小，不同溫度下小于1 000 u 分子質(zhì)量的大米低聚肽含量都在91%左右，其中大部分大米低聚肽分子質(zhì)量集中在480 u 左右，與25 ℃條件下相比，變化不超過3.07%。熱處理顯著降低大米低聚肽的在2 000～3 000 u，3 000～5 000 u 和＞5 000 u 范圍內(nèi)的分子質(zhì)量（P<0.05），顯著提高<150 u 范圍內(nèi)的分子質(zhì)量（P<0.05），然而對范圍在1 000～2 000 u，150～1 000 u，1 000 u 以下總計和重均分子質(zhì)量無顯著影響（P＞0.05）。這表明在大米低聚肽加工過程中，溫度因素對其組分分布的影響較小。這與陳亮等[14]研究不同溫度條件對玉米低聚肽的熱穩(wěn)定性影響的結(jié)果相同，也得出了溫度因素對各分子質(zhì)量區(qū)間的玉米低聚肽的含量基本沒有影響的結(jié)論。

表1 不同溫度下大米低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of rice oligopeptides at different temperatures

2.1.2 二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)決定功能，分析肽的二級或高級結(jié)構(gòu)，對研究其抗氧化活性非常重要[15]。因此，進一步對大米低聚肽在不同溫度下的二級結(jié)構(gòu)進行分析。肽的二級結(jié)構(gòu)改變，會使圓二色光譜的位置、吸收的強弱發(fā)生改變[11]。通過圓二色譜分析，解析出大米低聚肽二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、平行式β-折疊、反平行式β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲的比例。圖1顯示，不同溫度處理的大米低聚肽均在遠紫外區(qū)190 nm 附近有一負峰，在遠紫外區(qū)225 nm 附近有一正峰。與25 ℃條件下相比，40 ℃下大米低聚肽的圓二色光譜變化最大。由表2可知，反平行式β-折疊比例最高，其次是不規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋、平行式β-折疊。不同溫度對大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)尤其是反平行式β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲比例稍有影響，而變化不大，與25 ℃條件下相比，變化不超過1.24%。不同溫度下大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)均無顯著差異（P>0.05）。其原因可能是與蛋白質(zhì)相比，肽的結(jié)構(gòu)較為簡單，主要具有肽鏈一級結(jié)構(gòu)及二級結(jié)構(gòu)，不具有對熱敏感的更高級結(jié)構(gòu)，溫度對其形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞作用很小[15]。

圖1 不同溫度下大米低聚肽的圓二色光譜掃描Fig.1 Circular dichroism spectrum of rice oligopeptides at different temperatures

表2 不同溫度下大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structures of rice oligopeptides at different temperatures

2.1.3 氧自由基吸收能力 氧自由基吸收能力（Oxygen radical absorbance capacity，ORAC）是檢測抗氧化能力強弱的一個常用指標，ORAC 值越高，抗氧化活性越強[12]。不同濃度Trolox 標準液的動態(tài)熒光衰減曲線如圖2所示。經(jīng)計算，不同溫度下，大米低聚肽的ORAC 值見圖3，從圖中可以看出ORAC 值隨著溫度升高呈先升高后下降的趨勢，40 ℃下ORAC 值為（1 084.78±31.60）μmol/g，顯著高于其它溫度下的ORAC 值（P＜0.05），與25℃下相比（884.42 ± 27.17）μmol/g，抗氧化活性提高了22.65%。這可能是由于此溫度下熱處理改變了大米低聚肽的結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象，增強了氫轉(zhuǎn)移的抑制能力，進而使自由基鏈式反應終止，從而ORAC 值增加。這與40 ℃下大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)變化一致。其余溫度下，ORAC 值均保持在805.14～890.88 μmol/g 之間，沒有顯著性變化（P＞0.05），說明在此濃度范圍內(nèi)，抗氧化活性較穩(wěn)定。大米低聚肽的結(jié)構(gòu)使其對熱處理的敏感性較低，從而使得熱處理對其抗氧化活性的影響較小。許英一等[16]研究了加熱處理（20，40，60，80，100 ℃）對燕麥蛋白肽抗氧化活性的影響，結(jié)果與本研究一致，隨著溫度的升高，燕麥蛋白肽抗氧化活性先升高后降低，40 ℃下抗氧化活性最強。因為食品生產(chǎn)中熱處理是常見的操作，所以大米低聚肽的低熱敏感性有利于將其在飲料加工過程中作為原料使用。

圖2 不同濃度Trolox 的動態(tài)熒光衰減曲線Fig.2 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

圖3 不同溫度下大米低聚肽的ORAC 值Fig.3 ORAC values of rice oligopeptides at different temperatures

2.2 pH 值對大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響

2.2.1 分子質(zhì)量分布 大米低聚肽在初始pH 值以及pH 值分別為2，4，6，8，10 的條件下，在37℃水浴2 h，得到其分子質(zhì)量分布情況如表3所示。在不同pH 值條件下，各個分子質(zhì)量范圍的大米低聚肽比例變化很小，小于1 000 u 分子質(zhì)量的大米低聚肽總含量均在91%左右，其中大部分大米低聚肽的分子質(zhì)量集中在480 u 左右，變化不超過2.52%。pH 值為10 的大米低聚肽的分子質(zhì)量，在2 000～3 000 u 范圍內(nèi)的含量與其它pH 值條件下有顯著差異（P<0.05）。與其它pH 值條件相比，在pH 2 和pH 10 條件下，大米低聚肽的重均分子質(zhì)量變化稍大，這表明強酸和強堿環(huán)境對大米低聚的穩(wěn)定性有一定影響，加工過程中，應避免強酸和強堿環(huán)境。綜上所述，大米低聚肽具有較好的pH 穩(wěn)定性，這與王若敏等[17]研究不同酸堿性環(huán)境下大豆肽的分子質(zhì)量分布沒有顯著性變化的結(jié)果相似。陳亮等[14]在玉米低聚肽穩(wěn)定性的研究中也得出相同結(jié)論。

表3 不同pH 值下大米低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular weight distribution of rice oligopeptides at different pH values

2.2.2 二級結(jié)構(gòu) 不同pH 值下大米低聚肽的圓二色光譜分析結(jié)果如圖4所示，與熱處理結(jié)果一致，不同pH 值下大米低聚肽均在遠紫外區(qū)190 nm 附近有一負峰，在遠紫外區(qū)225 nm 附近有一正峰。與對照相比，不同pH 值下大米低聚肽190 nm 處的負峰增加，225 nm 處的正峰也略有增加，其中pH 4 下兩處圓二色光譜峰增加最多。由表4可知，二級結(jié)構(gòu)中，反平行式β-折疊比例最高，其次是不規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋、平行式β-折疊。不同pH 值下大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)比例稍有變化，其中α-螺旋、反平行式β-折疊和不規(guī)則卷曲有顯著影響（P<0.05），可能是肽分子上氫質(zhì)子分布發(fā)生變化所引起[18]。此外，肽在堿性環(huán)境下發(fā)生外消旋反應，一定程度上改變了肽鏈的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)[19-20]。然而與對照組相比，變化不超過10.88%。因此，不同pH 值下，大米低聚肽二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

圖4 不同pH 值下大米低聚肽的圓二色光譜掃描Fig.4 Circular dichroism spectrum of rice oligopeptides at different pH values

表4 不同pH 值下大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)Table 4 Secondary structures of rice oligopeptides at different pH values

2.2.3 氧自由基吸收能力 不同pH 值下大米低聚肽的ORAC 值見圖5。與對照相比 （834.16±27.82）μmol/g，pH 6 下大米低聚肽的ORAC 值為（930.31 ± 39.28）μmol/g，提高了11.53%，有顯著性變化（P＜0.05）。其余pH 值下，大米低聚肽的ORAC 值有所降低，其中pH 2 和pH 4 下ORAC值分別為（714.56±58.14）μmol/g 和（599.69± 30.90）μmol/g，與對照相比，分別降低了14.34%和28.11%，有顯著性變化（P＜0.05）。推測原因可能是此酸堿環(huán)境下引起疏水性氨基酸的結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象發(fā)生變化，從而降低大米低聚肽阻斷或打破自由基鏈式反應的抗氧化能力，由上述圓二色光譜分析結(jié)果可知，pH 4 下大米低聚肽的光譜峰變化最大，這可能是導致其ORAC 值變化最大的原因之一。堿性條件下，ORAC 值大于強酸性環(huán)境，可能是由堿性環(huán)境促使疏水性氨基酸殘基增多所引起，從而提高了其抗氧化活性。陳慶華等[21]研究了花生蛋白肽在酸堿性環(huán)境下的抗氧化能力穩(wěn)定性，其結(jié)論和本研究結(jié)論相一致。因此，應盡量避免大米低聚肽在酸性很強的環(huán)境下加工處理。

圖5 不同pH 值下大米低聚肽的ORAC 值Fig.5 ORAC values of rice oligopeptides at different pH values

2.3 體外消化對大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響

2.3.1 分子質(zhì)量分布 大米低聚肽分別經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和先胃蛋白酶再胰蛋白酶3 種消化模式消化后，測定出其分子質(zhì)量分布情況。從表6可以得出大米低聚肽經(jīng)過3 種消化模式消化后，分子質(zhì)量小于1 000 u 的大米低聚肽的組分總含量略有升高，重均分子質(zhì)量稍有降低，而不超過8.32%。綜上得出大米低聚肽對胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受作用。與未消化組相比，經(jīng)過消化后，分子質(zhì)量在1 000～2 000 u，2 000～3 000 u，3 000～5 000 u，大于5 000 u 和重均分子質(zhì)量的組分顯著下降（P＜0.05），而小于150 u 所占比例顯著升高（P＜0.05）。表明經(jīng)過消化后分子質(zhì)量相對較大的肽段分解成了分子質(zhì)量較小的肽段或氨基酸。從表5可知，對大米低聚肽的消化作用，胰蛋白酶要略強于胃蛋白酶，并且在這3 種消化模式中，先胃蛋白酶再胰蛋白酶消化模式使大米低聚肽中分子質(zhì)量小于1 000 u 的組分含量升高的最多。杜枘宣[22]研究了體外模擬胃腸消化酪蛋白，得出酪蛋白在模擬腸液消化模式下的水解度顯著高于胃液消化模式。

表5 不同消化方式下大米低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 5 Molecular weight distribution of rice oligopeptides in different digestion modes

2.3.2 二級結(jié)構(gòu) 不同消化模式下，大米低聚肽的圓二色光譜分析結(jié)果如圖6所示，消化前、后大米低聚肽均在遠紫外區(qū)190 nm 附近有一負峰，在遠紫外區(qū)225 nm 附近有一正峰。由表6可知，二級結(jié)構(gòu)中，反平行式β-折疊比例最高，其次是不規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋、平行式β-折疊。不同消化模式對大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)尤其是反平行式β-折疊和不規(guī)則卷曲比例稍有影響，然而變化不大，與對照相比，變化不超過1.06%。因此，不同消化模式下，大米低聚肽二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。在3種消化模式下，胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用位點和作用機理不同可能是造成大米低聚肽二級結(jié)構(gòu)差異的原因，并且胃蛋白酶和胰蛋白酶具有不同的酶解特性會使大米低聚肽水解成不同的肽段，從而在一定程度上引起二級結(jié)構(gòu)的變化[23]。

表6 不同消化模式下大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)Table 6 Secondary structures of rice oligopeptides in different digestion modes

圖6 不同消化模式下大米低聚肽的圓二色光譜掃描Fig.6 Circular dichroism spectrum of rice oligopeptides in different digestion modes

2.3.3 氧自由基吸收能力 不同消化模式下，大米低聚肽的ORAC 值見圖7。胃蛋白酶消化1 h后，大米低聚肽ORAC 值顯著低于對照組（P＜0.05），降低了11.09%；胰蛋白酶消化4 h 后，ORAC 值提高了0.65%，先胃蛋白酶消化1 h 再胰蛋白酶消化4 h，ORAC 值顯著高于對照組（P＜0.05），提高了17.78%。這與Schmelzer 等[24]研究的β-酪蛋白和劉珊珊等[25]研究的酪蛋白肽經(jīng)模擬胃腸消化后的降解規(guī)律一致。推測原因可能是由于胃蛋白酶將部分高活性肽段酶切降解，阻礙了肽段與自由基的反應，使低聚肽對自由基的清除能力略有下降。在消化能力方面胰蛋白酶要優(yōu)于胃蛋白酶，能夠?qū)⒋竺椎途垭拿附獬筛》肿淤|(zhì)量的肽段，從而引起一些疏水性基團暴露，使得肽段表面疏水性增強，并且相關研究指出自由基清除活性與疏水性氨基酸或肽的含量有關[25]。體外模擬人體胃腸消化，先胃蛋白酶再胰蛋白酶消化模式下，大米低聚肽進一步生成小肽（主要為二肽、三肽等），暴露更多活性基團，大大增加與自由基反應的機會，從而增強對自由基的清除能力，并且對大米低聚肽的抗氧化活性提高具有較好的促進作用[26]。

圖7 不同消化模式下大米低聚肽的ORAC 值Fig.7 ORAC values of rice oligopeptides in different digestion modes

3 結(jié)論

大米低聚肽具有球體顆粒狀和弧形片狀結(jié)構(gòu)，總蛋白質(zhì)含量為（95.75±1.72）%，低聚肽含量為（89.11±0.94）%，富含抗氧化性氨基酸。熱處理顯著改變大米低聚肽在3 000～5 000 u、2 000～3 000 u 和＞5 000 u 的分子質(zhì)量（P<0.05），顯著提高<150 u 分子質(zhì)量（P<0.05），然而對重均分子質(zhì)量、二級結(jié)構(gòu)無顯著影響（P＞0.05），40 ℃下大米低聚肽的ORAC 值顯著高于其它溫度（P<0.05）；pH值對大米低聚肽的重均分子質(zhì)量、α-螺旋和平行式β-折疊無顯著影響（P＞0.05），pH 值變化可顯著改變大米低聚肽ORAC 值（P<0.05）；體外模擬消化顯著改變大米低聚肽的分子質(zhì)量分布（P<0.05），然而對大米低聚肽的二級結(jié)構(gòu)無顯著影響（P＞0.05），先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化可顯著提高大米低聚肽的ORAC 值（P<0.05）。

通過研究不同加工條件和消化方式對大米低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的影響，證明其在生產(chǎn)加工過程以及人體胃腸道環(huán)境下，大米低聚肽能保持較強的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗氧化活性，因此在飲料工業(yè)中具有廣闊的應用前景。本試驗結(jié)果為大米低聚肽在抗氧化功能性飲料的開發(fā)和應用提供了理論參考。