葉文麗 雍翔智# 吳恬恬 廖海清 蘇志恒 陶人川*

1 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會口腔感染性疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530000；2 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530000

慢性牙周炎是全球第6大流行疾病，全球患病人數(shù)約達(dá)7.43億人，總發(fā)病率為11.2%，該病可嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭氏陰性厭氧菌，是牙周炎的主要致病菌，可局部入侵牙周組織，逃避宿主防御機(jī)制，表達(dá)多種毒力因子削弱機(jī)體免疫系統(tǒng)，破壞牙周組織[2]。因此，清除和控制P.gingivalis等口腔致病菌是臨床治療牙周炎的主要手段之一。

目前，局部或全身使用抗生素是臨床常用的牙周炎輔助治療方式，但長期使用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性[3-4]。巖黃連是一種多年生草本植物，是廣西的特色中草藥。研究表明巖黃連具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等作用[5-8]。巖黃連總堿(CorydalissaxicolaBunting total alkaloids, CSBTA)是巖黃連的有效成分，主要由脫氫卡維丁、小檗堿、巴馬汀組成[9]。目前，關(guān)于CSBTA對P.gingivalis是否具有抗菌活性尚未見報告，因此本研究初步探究CSBTA對P.gingivalis的體外抑菌效果?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備P.gingivalisATCC 33277菌株購自廣東省菌種保藏中心。CSBTA由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室提供。胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth, TSB)培養(yǎng)基，氯化血紅素，維生素K1，哥倫比亞血瓊脂平板，革蘭氏染色試劑盒，恒溫厭氧培養(yǎng)箱YQX-Ⅱ(上海新苗，中國)，酶標(biāo)儀Infinite 200pro(TECAN，瑞士)。

1.2 研究方法

1.2.1 菌種的復(fù)蘇和培養(yǎng) 將凍存于-80 ℃冰箱的P.gingivalis菌種取出，菌種在常溫環(huán)境下解凍后接種在哥倫比亞血瓊脂平板上進(jìn)行復(fù)蘇，將平板倒置于80%氮?dú)狻?0%二氧化碳、10%氫氣，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。待平板上形成形態(tài)均一的灰黑色菌落后，挑取若干單克隆菌落接種至TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

1.2.2P.gingivalis的鑒定及其對數(shù)生長期的測定 細(xì)菌在37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，刮取適量細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，結(jié)合形態(tài)學(xué)等進(jìn)行菌株鑒定，確認(rèn)其為P.gingivalis后，取單克隆菌落接種至TSB培養(yǎng)基中，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、32 h、40 h、48 h時各取200 μL菌液置于96孔板中，采用酶標(biāo)儀在600 nm波長下測定光密度值(optical density, OD)，繪制生長曲線。

1.2.3 CSBTA對P.gingivalis的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同濃度CSBTA溶液的配制 將CSBTA溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，配制成20 g/L CSBTA溶液，再將其稀釋為0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L CSBTA溶液備用。

1.2.3.2P.gingivalis菌懸液的制備 取適量P.gingivalis加入TSB培養(yǎng)基，在80%氮?dú)狻?0%二氧化碳、10%氫氣，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。取對數(shù)生長期的菌液，用TSB培養(yǎng)基將菌液調(diào)整至0.5麥?zhǔn)奖葷針?biāo)準(zhǔn)菌懸液(1.5×108CFU/mL)備用。

1.2.3.3 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 將對數(shù)生長期P.gingivalis菌懸液(1.5×108CFU/mL)加入96孔板中(100 μL/孔)，分別加入0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L CSBTA溶液100 μL和DMSO溶液100 μL，每個濃度各設(shè)三個復(fù)孔。將該96孔板置于80%氮?dú)狻?0%二氧化碳、10%氫氣，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，黑色背景下肉眼觀察菌液無渾濁出現(xiàn)的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。

分別取5 μL MIC以上的各組菌液點(diǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板上，在37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，抑制細(xì)菌明顯增長(平板上菌落數(shù)為0)的最低藥物濃度即為最小殺菌濃度(minimal bacteriocidal concentration，MBC)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 CSBTA對P.gingivalis的相對生長抑制率的測定 將對數(shù)生長期P.gingivalis菌懸液(1.5×108CFU/mL)加入96孔板中(100 μL/孔) ，分別加入0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L、0.64 g/L CSBTA溶液100 μL作為實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置三個復(fù)孔；另設(shè)置一孔加入DMSO溶液100 μL作為對照組，設(shè)三個復(fù)孔。在37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，采用酶標(biāo)儀測量600 nm波長下各孔OD，計算不同濃度CSBTA下P.gingivalis的相對生長抑制率。相對生長抑制率=[對照組OD增長值-實(shí)驗(yàn)組OD增長值]/對照組OD增長值×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 CSBTA對P.gingivalis的生長曲線的影響 取相應(yīng)濃度的CSBTA溶液(0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L)和對數(shù)生長期P.gingivalis菌懸液(1.5×108CFU/mL)各2.5 mL混合均勻，將CSBTA終濃度分別為1/4MIC、1/2MIC、MIC作為實(shí)驗(yàn)組；將DMSO溶液與對數(shù)生長期P.gingivalis菌懸液(1.5×108CFU/mL)各2.5 mL混合均勻后作為對照組。分別在0、4、8、12、16、20、24 h時各吸取200 μL菌液置于96孔板中，采用酶標(biāo)儀測量600 nm波長下各孔OD，并繪制生長曲線。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法或Dunnett T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1P.gingivalis的鑒定及其對數(shù)生長期的測定 經(jīng)革蘭氏染色鏡檢顯示，P.gingivalis在鏡下呈紅色，為革蘭氏陰性菌。P.gingivalis在培養(yǎng)4～20 h時處于對數(shù)生長期，細(xì)菌快速增殖，20 h后細(xì)菌增殖逐漸進(jìn)入平臺期，細(xì)菌生長較為緩慢。見圖1和圖2。

圖1 P.gingivalis革蘭氏染色(100×)

圖2 48 h內(nèi)P.gingivalis正常生長曲線

2.2 CSBTA對P.gingivalis的藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)48 h的厭氧培養(yǎng)后，0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L CSBTA下的菌液均無渾濁出現(xiàn)，故CSBTA對P.gingivalis的MIC為0.08 g/L。選擇0.08 g/L、0.16 g/L和 0.32 g/L CSBTA溶液進(jìn)行MBC測定，結(jié)果顯示CSBTA對P.gingivalis的MBC為0.16 g/L。見圖3。

圖3 CSBTA對P.gingivalis的MBC測定

2.3 CSBTA對P.gingivalis的相對生長抑制率的測定 不同濃度(0.01 g/L、0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L、0.16 g/L、0.32 g/L)CSBTA對P.gingivalis的相對生長抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CSBTA濃度為0.02 g/L時，50%以上細(xì)菌生長受到抑制；CSBTA濃度為0.08 g/L時，90%以上細(xì)菌生長受到抑制。見表1和圖4。

表1 不同濃度CSBTA對P.gingivalis的相對生長抑制率 (x±s)

圖4 不同濃度CSBTA對P.gingivalis 的相對生長抑制率(與0 g/L CSBTA處理時比較，*P<0.05)

2.4 CSBTA對P.gingivalis生長曲線的影響 與對照組相比，各濃度CSBTA實(shí)驗(yàn)組對P.gingivalis生長均有不同程度的抑制，且呈濃度依賴性。0.02 g/L、0.04 g/L組細(xì)菌生長呈緩慢增長趨勢，而0.08 g/L組P.gingivalis增長幾乎完全受到抑制。見圖5。

圖5 24 h內(nèi)不同濃度CSBTA對P.gingivalis生長的影響

3 討 論

牙周炎是一種由細(xì)菌引起的炎癥性疾病，可累及牙周結(jié)締組織和牙槽骨等支持組織，引起牙齒松動、脫落[10]。P.gingivalis是牙周炎致病菌，能夠在牙周組織定植，并通過產(chǎn)生多種毒力因子降低宿主的免疫防御能力[11-12]，破壞牙周微環(huán)境平衡，造成牙周組織破壞。此外，P.gingivalis參與了牙菌斑生物膜的形成，而牙菌斑生物膜使得P.gingivalis具有更高的致病力，使其對抗生素的耐藥性更強(qiáng)[13-16]。

目前，臨床上牙周炎的主要治療方法是通過機(jī)械手段去除牙菌斑，如果患者合并局部感染狀態(tài)，則應(yīng)用抗生素進(jìn)行輔助治療，但長期應(yīng)用抗生素可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥等問題的發(fā)生。近年來，關(guān)于抗P.gingivalis天然藥物成分的開發(fā)與應(yīng)用的研究已取得了一些進(jìn)展。體外研究[17-18]表明，天然藥物成分白藜蘆醇和姜黃素對P.gingivalis的生長及其部分毒力因子的表達(dá)均具有顯著的抑制作用。Tsou等[19]的研究顯示，咖啡中的綠原酸對P.gingivalis具有抑制和殺滅作用并且能夠降低P.gingivalis相關(guān)蛋白酶活性。Yoshimasu等[20]報告，天然藥物蜂膠能夠通過增加P.gingivalis膜通透性誘導(dǎo)其死亡。巖黃連作為一種特色天然中草藥，其有效成分CSBTA對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀菌等多種常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用[21-22]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CSBTA能夠有效地抑制THP-1來源的巨噬細(xì)胞M1極化和焦亡，減少炎癥因子白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α的表達(dá)[23]。本研究立足于廣西特色天然藥物巖黃連，結(jié)合課題組前期研究探索CSBTA對P.gingivalis的體外抑菌作用。

本研究結(jié)果顯示，P.gingivalis在培養(yǎng)4～20 h時處于對數(shù)生長期。故本研究繪制培養(yǎng)24 h內(nèi)不同濃度CSBTA 下P.gingivalis的生長曲線，觀察其對P.gingivalis的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，0.02 g/L、0.04 g/L CSBTA作用下P.gingivalis生長呈緩慢增長趨勢，而0.08 g/L CSBTA作用下P.gingivalis生長幾乎完全受到抑制，且CSBTA對P.gingivalis生長抑制具有明顯的濃度依賴性。以上結(jié)果提示CSBTA對P.gingivalis的體外生長具有較強(qiáng)的抑制作用，且CSBTA濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。本研究確定了CSBTA對P.gingivalis的MIC(0.08 g/L)與MBC(0.16 g/L)，在MIC濃度下超過90%的P.gingivalis生長受到抑制，在MBC以上濃度的哥倫比亞血瓊脂平板上無細(xì)菌菌落形成。

目前在臨床上，以CSBTA為主要成分的巖黃連注射液已被廣泛用于治療急慢性病毒性肝炎、肝癌、直腸癌等疾病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSBTA對P.gingivalis的MIC為0.08 g/L，MBC為0.16 g/L，均遠(yuǎn)低于臨床使用的巖黃連注射液中CSBTA含量(0.35 g/L)，故使用MIC或MBC治療牙周炎可能有較高的生物安全性。

綜上所述，CSBTA對P.gingivalis具有較強(qiáng)的體外抑菌活性與較高的生物安全性，有望成為新型的牙周炎輔助治療藥物。