盧 野，董右銘

（四平市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗院，吉林 四平 136000）

噬菌體（bacteriophage） 是感染細(xì)菌的一種病毒，噬菌體分布極廣，凡是有細(xì)菌的場所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在[1]。由于其可以在宿主體內(nèi)快速復(fù)制及繁殖的特性，目前被廣泛用于抑制多種食源性致病菌的感染[2-3]。但在酸奶發(fā)酵過程中所需要的乳酸菌也逃脫不了噬菌體的感染，造成乳酸菌產(chǎn)酸量降低產(chǎn)生的品質(zhì)問題，從而導(dǎo)致生產(chǎn)方的經(jīng)濟損失[4-6]。酸奶目前銷售量不斷上升，人們對酸奶飲品的青睞也日益提高，但噬菌體的感染使酸奶在發(fā)酵過程中風(fēng)味變差，品質(zhì)下降甚至產(chǎn)酸終止等現(xiàn)象一直困擾著酸奶業(yè)。目前，關(guān)于乳酸菌噬菌體的分離，酸奶發(fā)酵中噬菌體污染的預(yù)防已有很多報道，但對乳酸菌噬菌體的功能基因開發(fā)、鑒定卻研究很少[7-8]。試驗對酸奶中分離到的保加利亞乳桿菌噬菌體CC34 的裂解基因進行克隆、表達及功能的初步鑒定，為酸奶工業(yè)噬菌體污染的預(yù)防奠定基礎(chǔ)[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株與質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α（TaKaRa）、pET-28b（+）（Novagen）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、噬菌體CC34，實驗室提供。

1.1.2 試劑

凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組DNA 提取試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、Taq 酶，大連寶生物公司 （TaKaRa） 提供；DNA 純化試劑盒，長春庫美生物科技有限公司提供；Gold erView染料（SBS）、中范圍蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量（MBI），長春翊博生物科技有限公司提供；TAE 電泳緩沖液，Tris 緩沖液 （pH 值 7.2）、PBS 緩沖液 （pH 值 7.2）、Tris - 甘氨酸電極緩沖液，由實驗室事先配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 裂解基因e 的PCR 擴增

根據(jù)噬菌體CC34 片段測序結(jié)果，對e 基因開放閱讀框設(shè)計一對特異性引物（ATAGCCATGGCAGGCATTCGTTG，下劃線為Nco Ⅰ酶切位點） 及（ATG-GGTCGACGGTAAGCCTGGAA，下劃線為SalⅠ酶切位點），由大連TaKaRa 公司合成。以噬菌體基因組DNA 為模板，擴增條件為94 ℃，3 min；94 ℃，45 s；57 ℃，45 s；72 ℃，90 s；總共循環(huán) 30 次；72 ℃延伸10 min。擴增結(jié)束后取2 μL PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，在紫外照射下回收目的片段，根據(jù)TaKaRa 凝膠回收試劑盒說明書對e 基因的PCR 擴增產(chǎn)物回收純化，將產(chǎn)物放置在-20 ℃下保存。

1.2.2 表達載體pET- 28b（+）- e 的構(gòu)建及鑒定

擴大培養(yǎng)含有pET-28b（+）質(zhì)粒的大腸桿菌，按照TaKaRa 質(zhì)粒小提試劑盒提取pET-28b（+）質(zhì)粒，與1.2.1 得到的膠回收產(chǎn)物分別用NcoⅠ和SalⅠ2種限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后純化回收2種產(chǎn)物，以質(zhì)?！肈NA = 1∶10 的比例用T4 連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后挑取疑似陽性菌落通過雙酶切進行鑒定是否轉(zhuǎn)化成功。

1.2.3 pET- 28b（+）- e 的 IPTG 誘導(dǎo)表達

將轉(zhuǎn)化成功的pET-28b（+）-e 的大腸桿菌BL21接種至5 mL LB 液體培養(yǎng)基（含25 μg/mL 卡那霉素）中，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜；以1%的接種量接種至50 mL LB 液體培養(yǎng)基（含25 μg/mL卡那霉素） 中，培養(yǎng)溫度及轉(zhuǎn)速與上述步驟相同，OD600達 0.4～0.6； 加 入 500 μL IPTG 至 終 濃 度 為1 mmol/L 誘導(dǎo)，繼續(xù)以相同的培養(yǎng)溫度及轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，每間隔1 h 取誘導(dǎo)后的菌液1 mL；將菌液離心后分別收集上清液和沉淀物，沉淀物用50 μL PBS 重懸沉淀，于-20 ℃下保存待用。

1.2.4 pET- 28b（+）- e 表達產(chǎn)物 SDS- PAGE分析

細(xì)菌沉淀加入2×SDS 樣品緩沖液50 μL，充分混勻后，放置沸水中煮5 min，配制12.5%的SDSPAGE分離膠，5%濃縮膠，取10 μL 樣品電泳，電泳結(jié)束后用銀染法顯色。

1.2.5 pET- 28b（+）- e 細(xì)菌的溶菌試驗

將1.2.3 步驟中誘導(dǎo)表達的細(xì)菌沉淀分別用TBS和PBS 重懸，冰浴超聲 10 s，間隔 10 s，30～50 循環(huán)，直至樣品變清亮；超聲完成后，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心20 min，轉(zhuǎn)移上清進行溶菌試驗。取100 μL 生長到對數(shù)期的指示菌（保加利亞乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）分別與3 mL LB半固體培養(yǎng)基混勻，均勻鋪在有下層LB 固體培養(yǎng)基上。將無菌的牛津杯放在鋪有指示菌的上層瓊脂上，依次加入 100 μL 的 pET-28b（+）-e，pET-28b（+）（空白對照） 的超聲上清，于30 ℃下培養(yǎng)過夜，第2 天觀察溶菌圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂解基因e 的PCR 擴增結(jié)果

以噬菌體基因組為模板，可以擴增得到一條大小在490 bp 左右的特異性條帶，與目的片段e 基因的大小相符。

裂解基因e 的PCR 擴增結(jié)果見圖1。

圖1 裂解基因e 的PCR 擴增結(jié)果

2.2 表達載體pET-28b（+）-e 的雙酶切鑒定結(jié)果

用 Nco Ⅰ和 Sal Ⅰ對構(gòu)建好的 pET-28b（+）-e 載體進行雙酶切，得到5.3 kD 和490 bp 2 條片段（圖2），分別對應(yīng)pET-28b（+）和e 基因的大小，與預(yù)期結(jié)果一致。

雙酶切鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 pET-28b（+）-e 表達產(chǎn)物 SDS-PAGE分析

pET-28b（+）-e 的細(xì)菌沉淀總蛋白及表達上清總蛋白在18 kD 附近都有一明顯的蛋白表達帶（黑箭頭所指），分子量大小與預(yù)期相符。pET-28b（+）-e在誘導(dǎo)表達后的第2，第3 小時的表達量最大，之后減少。與之相反的是pET-28-e 的表達上清的目的蛋白在誘導(dǎo)表達的后期（4，5，6 h） 卻增加（圖4）。出現(xiàn)這種情況的原因是pET-28-e 在誘導(dǎo)表達時會出現(xiàn)溶菌，表達宿主的大量死亡，使本來胞內(nèi)表達的e蛋白釋放到培養(yǎng)液里。

pET-28b（+）-e 細(xì)菌沉淀總蛋白的 SDS-PAGE見圖3，pET-28b（+）-e 表達上清總蛋白的SDS-PAGE見圖4。

圖3 pET-28b（+）-e 細(xì)菌沉淀總蛋白的SDS-PAGE

圖4 pET-28b（+）-e 表達上清總蛋白的SDS-PAGE

2.4 pET-28b（+）-e 蛋白粗提液的溶菌試驗結(jié)果

pET-28-e 細(xì)菌沉淀超聲所得到的粗提液對保加利亞乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌都有不同程度的溶菌作用，而且其在Tris 緩沖液的活性比PBS 緩沖液的活性強。

pET-28b（+）-e 蛋白粗提液對不同細(xì)菌的溶菌試驗結(jié)果見表1。

表1 pET-28b（+）-e 蛋白粗提液對不同細(xì)菌的溶菌試驗結(jié)果

3 結(jié)論

成功構(gòu)建了酸奶中乳酸菌噬菌體CC34 的裂解基因 e 的表達載體：pET-28b（+）-e。pET-28b（+）-e的胞內(nèi)表達，使e 的表達量有極大的提高，根據(jù)溶菌試驗的證明，pET-28b（+）-e 表達的e 對多種細(xì)菌都有溶菌作用，e 的表達量大，但溶菌活性表現(xiàn)還不是很強，可能是pET-28b（+）-e 表達有相當(dāng)一部分形成沒有活性的包涵體，只有少部分以可溶性蛋白表達的原因?？赏ㄟ^降低誘導(dǎo)表達的培養(yǎng)溫度來增加可以溶性蛋白的表達量，以增加pET-28b（+）-e 的溶菌活性[11-13]。pET-28b（+）-e 的蛋白粗提液表現(xiàn)出對TBS 的偏好性，在PBS 中，溶菌活性被完全抑制了。

很多噬菌體進入宿主機體的關(guān)鍵步驟就是通過溶菌酶打開細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的多種共價鍵，使肽聚糖降解，造成細(xì)菌的死亡，這種能力在人類病原菌治療、食品、植物病害防治等方面有著很大的開發(fā)利用價值[14-15]。所研究的裂解基因e 和溶菌酶基因在理化性質(zhì)上有很多相似的地方，所做的研究也為進一步了解噬菌體病毒包裝機制奠定了基礎(chǔ)。