任麗，吳錫驊，劉婷，梅益彰，蘇施雅

(佛山復星禪誠醫(yī)院，廣東 佛山 528031)

動脈粥樣硬化是多種疾病發(fā)展的主要原因，如腦卒中、心肌梗死和外周動脈疾病，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)是動脈粥樣硬化發(fā)展的重要觸發(fā)因素[1-2]。動脈粥樣硬化是腦卒中發(fā)生的主要原因之一，由它引起的腦卒中具有非常高的發(fā)病率和致殘率[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，阻止內皮細胞凋亡可以抑制動脈粥樣硬化進展[5]；人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，GRb1)是人參皂苷的主要成分，具有多種生物活性，包括抗氧化應激、抗炎等[6]，GRb1可通過抑制細胞凋亡對ApoE-/-小鼠早期動脈粥樣硬化發(fā)揮抑制作用[7]，但其抑制內皮細胞凋亡的具體機制尚不完全清楚。有研究表明，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1(hydroxymethylglutaryl-goA reductase degradation protein 1，HRD1)參與動脈粥樣硬化的發(fā)生，在患者中呈低表達狀態(tài)[8]；有報道GRb1可通過激活HRD1信號通路從而減輕小鼠結腸炎癥狀[9]；但GRb1能否通過調控HRD1信號通路抑制動脈粥樣硬化介導的內皮細胞凋亡尚不明確。因此，本研究利用ox-LDL處理人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells，HAECs)構建動脈粥樣硬化細胞模型，探究GRb1對動脈粥樣硬化介導的內皮細胞凋亡的影響以及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 人主動脈內皮細胞HAECs(上海啟達生物，貨號ACBRI 375)。

1.1.2主要試劑 HRD1小干擾RNA(si-HRD1)及其陰性對照si-NC購自北京百泰派克生物科技有限公司，CCK-8試劑盒(貨號YT8193)購自北京伊塔生物科技有限公司，雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海高創(chuàng)化學科技有限公司，貨號G003-1)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，貨號F01963)，超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)試劑盒(北京杰輝博高生物技術有限公司，貨號JM-ELISA-15098)。兔源一抗HRD1(貨號ab170901)、B細胞淋巴瘤-2(b-cell lymphoma 2，Bcl-2，貨號ab32124)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspastic acid-specific protease 3，Caspase-3，貨號ab184787)、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(bcl-2-associated X，Bax，貨號ab32503)、GAPDH(貨號ab9485)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(貨號ab97051)購于Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 將HAECs細胞置于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的HAECs細胞，將其分為正常對照組(NC組)、模型組、GRb1組、GRb1+si-NC組(si-HRD1陰性對照組)和GRb1+si-HRD1組。其中模型組、GRb1組、si-HRD1陰性對照組和GRb1+si-HRD1組HAECs細胞分別對應用0 μmol/L GRb1、50 μmol/L GRb1[10]、50 μmol/L GRb1+轉染si-NC、50 μmol/L GRb1+轉染si-HRD1[8]處理12 h后，加入100 μg/mL ox-LDL[11]處理24 h。NC組細胞正常培養(yǎng)，不做任何處理。

1.2.2HAECs細胞活力 將HAECs細胞以5×103個/100 μL的密度接種到96孔板中，經(jīng)過相應的藥物處理后，將10 μL CCK-8溶液加入每個孔中，并在37 ℃下孵育4 h；使用酶標儀檢測450 nm處的OD值來評估細胞活力。細胞活力(%)=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(NC組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.3氧化應激指標的檢測SOD和MDA表達 除去各組細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次后，加入含有10 μmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃下孵育30 min后，利用熒光顯微鏡觀察細胞在激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm處的熒光強度，通過熒光強度的強弱反映細胞內的活性氧(ROS)水平；按照SOD、MDA試劑盒說明書操作步驟檢測細胞裂解液中SOD、MDA水平。

1.2.4HAECs細胞凋亡 收集各組HAECs細胞，并用PBS洗滌2次，再向細胞中加入100 μL 1×結合緩沖液、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫下孵育15 min，然后再加入100 μL 1×結合緩沖液，利用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.5Caspase-3、Bax、Bcl-2、HRD1蛋白表達 將細胞用PBS洗滌2次后，裂解提取總蛋白。加入抗體Caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、HRD1(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)，山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h，通過ECL化學發(fā)光試劑盒檢測蛋白質條帶顯色情況，通過ImageJ軟件對蛋白質條帶的灰度值進行定量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HAECs細胞活力

與NC組比較，模型組HAECs細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，GRb1組HAECs細胞的活力升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GRb1組、si-HRD1陰性對照組比較，GRb1+si-HRD1組HAECs細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組HAECs細胞活力比較

2.2 SOD、ROS、MDA水平

與NC組比較，模型組SOD水平降低，ROS、MDA水平則呈升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，GRb1組SOD水平升高，ROS、MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GRb1組、si-HRD1陰性對照組比較，GRb1+si-HRD1組SOD水平顯著降低，MDA、ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組HAECs細胞內ROS表達(熒光法，×100)

表2 各組HAECs細胞中SOD、MDA水平

2.3 HAECs細胞凋亡

與NC組比較，模型組HAECs細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，GRb1組HAECs細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GRb1組、si-HRD1陰性對照組比較，GRb1+si-HRD1組HAECs細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 流式細胞儀分析各組HAECs細胞凋亡情況

表3 各組HAECs細胞凋亡率比較

2.4 Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

與NC組比較，模型組HAECs細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，GRb1組HAECs細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GRb1組、si-HRD1陰性對照組比較，GRb1+si-HRD1組HAECs細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 Western blot檢測HAECs細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

表4 各組HAECs細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

2.5 HRD1通路相關蛋白在HAECs細胞中的表達

與NC組比較，模型組HAECs細胞中HRD1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，GRb1組HAECs細胞中HRD1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GRb1組、si-HRD1陰性對照組比較，GRb1+si-HRD1組HAECs細胞中HRD1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 Western blot檢測HAECs細胞中HRD1蛋白表達

表5 各組HAECs細胞中HRD1蛋白表達

3 討論

動脈粥樣硬化是腦血管疾病發(fā)生的主要原因。大量研究證實，ox-LDL是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素，ox-LDL通過與低密度脂蛋白受體1結合誘導ROS大量產生，大量的ROS可以進一步上調ox-LDL的形成并激活脂質過氧化，這可能導致細胞凋亡和氧化應激增加[12-13]。有研究報道，ROS的增加會促使血管內皮細胞氧化應激增加，與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有相關性[14]；SOD、MDA分別作為衡量機體抗氧化、氧化能力的重要指標，已有研究顯示在動脈粥樣硬化大鼠血清中，MDA含量上升，SOD活性下降[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，模型組HAECs細胞中SOD水平顯著降低，ROS、MDA水平則顯著升高，提示ox-LDL誘導的HAECs細胞氧化應激增加。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ROS誘導的氧化應激增加，最終會促進血管內皮細胞的凋亡。作為細胞凋亡的標志性蛋白，Bcl-2可促進細胞存活，Bax會增加細胞凋亡，而Caspase-3作為調節(jié)中心來控制細胞凋亡的發(fā)生，且在進一步激活凋亡酶方面發(fā)揮核心作用[17-18]。與NC組比較，模型組HAECs細胞活力、Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低，細胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白相對表達量顯著升高，表明ox-LDL誘導的HAECs細胞存在大量凋亡現(xiàn)象。以上結果提示，ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化細胞模型構建成功。GRb1是從人參中提取的主要活性成分之一[19-20]，近年來發(fā)現(xiàn)GRb1還具有強大的血管保護潛力[21-22]。如GRb1可抑制大鼠球囊損傷引起的頸動脈新生血管內膜增生[23]；GRb1可促進受損頸動脈的再內皮化[24]；GRb1在動脈粥樣硬化患者中有穩(wěn)定斑塊的作用[25]。而關于GRb1對動脈粥樣硬化介導的內皮細胞凋亡的影響鮮有報道。本研究結果顯示，與模型組比較，HAECs細胞經(jīng)GRb1處理后活力升高，氧化應激減弱，細胞凋亡率顯著降低，提示GRb1可能通過抑制氧化應激降低ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡。HRD1是一種E3泛素連接酶，已有研究報道，上調HRD1表達可抑制ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡[8]；高表達的HRD1能夠抑制ox-LDL導致的人臍靜脈血管內皮細胞凋亡[26]。而GRb1能否通過調控HRD1通路抑制ox-LDL誘導的HAECs細胞凋亡尚不清楚。本研究結果顯示，與NC組對比，模型組HAECs細胞中HRD1蛋白相對表達量顯著降低，推測HRD1通路可能參與了ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡過程。與模型組比較，GRb1組HAECs細胞中HRD1蛋白相對表達量顯著升高，推測GRb1可能通過激活HRD1通路抑制低ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡。為了驗證該推測，本研究利用HRD1小干擾RNA進行干預，結果顯示，與GRb1組比較，GRb1+si-HRD1組HAECs細胞中HRD1蛋白相對表達量、細胞活力降低，氧化應激增強，細胞凋亡率升高，表明si-HRD1可逆轉GRb1對ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡的抑制作用。

綜上所述，GRb1可能通過激活HRD1通路抑制氧化應激，進而抑制ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡。然而關于GRb1調節(jié)ox-LDL誘導的動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡涉及的通路較多，有待后續(xù)實驗進一步深入探究。